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プロトコール集 - (2011/11/28 (月) 19:09:31) のソース
*機器
**デジタルカメラ(池内研)
CANON EOS X4＋単焦点マクロ50mm＋保護フィルター
・ゲル写真：Av絞り優先オートモード、F14より暗くする、ISO=100画質最大
・プレート写真：Av絞り優先オートモード、F14より暗くする、ISO=100画質最大、ホワイトバランス調整が必要
・ホワイトバランス調整：１．基準の背景を撮影→２．MENUボタン･左上→左２つ目アイコン=露出補正など→３．上下選択ボタンでMWB画像選択を選択→４．SETボタン→５．画像を表示→６．左右選択ボタンで基準画像を表示→７．その画像を選択=SETボタン→８．「使用します」=OKを選択→９．SETボタン→MENUボタンで、撮影モードに戻る。
・撮影時のマニュアルホワイトバランス選定：１．リングボタンのWBを押す→２．マニュアルWB(画面右端)を選択→３．SETボタン
**オートクレーブ(共通)
・開けていいときは○、駄目なときは×。回数を書いて10回になったら洗う。
・ゴミ用は5回
・蒸気漏れがあっても、圧力、温度が下がるまで、絶対に開いてはいけない。開くと、大やけどのおそれあり
**プレート
-使用後は溜めておき、みんなでゲルを剥がしてオートクレープ→地下ゴミ置
き場(要カギ)
**分光光度計(UV-2400PC)
・透明なサンプルの測定に適、細胞の吸収スペクトル測定には不適
-セルは下部が凹んでるのがたまにあるので注意
**分光光度計(U-3500)
・細胞の吸収スペクトル測定に適→プロトコル参照
**FMBIO
FMBIO用の板にサンプル乗せて、輪ゴムなど目印も置いておく→POWER ON(スイッ
チはカバーの中にある)→PC:Acrylamide→範囲を適当に選んでPreRead→範囲
を選んでRead(5分ぐらいかかる)→TIF形式で保存
-出力が8bitTIF形式なのでPhotoshopでBMPなどにコンバートしておく
**液体窒素
-カード・液体窒素容器
-容器を置く(1)後はカード・スイッチを順番に。容器置き場に乗らないように
注意
-左にあるスイッチとタイマーで管の排気が出来るが、うるさい。
**綿ろ管
目盛アリは目盛が消えかけてないか確認し、シリコ栓してオートクレープ
目盛ナシは管と青梅綿を詰めて150℃ 4h
**綿ろ管洗浄
中身はシアノ用廃液に。綿栓を捨ててオートクレープして洗う
シアノ用廃液は溜まったらアルミでフタをしてオートクレープして捨てる
**チップ捨て
チップをオートクレープ→カギB27。16号館B1ゴミ捨て室でクリップ付けてか
ごに入れる、排水閉める、水入れて60分で運転→60℃インキュベーターで乾燥
→ハコへ
**CBB廃液
NaOH35gで大体中和。pH試験紙で確認して捨てる
**pHメータ
-MANU→安定するまで待つ→READ STANDBY
--サンプルが乗るように二本のスタンダードで調整する
-NORで大まかな値
-EXPでDISPLACE基準の細かい範囲に
-校正は中性に近い側をASYMMで、遠い方をSENSで微調節
**フレンチプレス
-3号館鍵・試料・100%EtOH・MilliQ
--3号館2階の低温室に一式があり、油圧ポンプは実習準備室にある
--3回ぐらい繰り返す。途中でシリンダーを氷冷する。
-シリンダーにピストンを、一番下の目盛まで差し込み、ホルダーに掛けてお
く
-サンプルをシリンダーに入れ、密閉プラグの大きい方の穴に円錐弁を尖った
方を先にして入れ、そこに流量調節バルブを差して閉める
-チューブを小さい方の穴に取り付ける
-密閉プラグをシリンダーに取り付ける
--流量調節バルブを少し緩めておくと空気が抜けて差し込みやすい
-プレス台に、シリンダーが上になるように乗せて、シリンダーの上にキャッ
プを乗せる
-板(工具箱)を用いて流量調節プラグをきつく締める
-油圧ポンプをON Pressure controlを開いた状態(尤も左)でUP
-台が上がりきったらPressure controlを閉めていき、1600kg/m&sup(2)にする
-板(工具箱)で少しずつ流量調整バルブを緩めながらPressure controlを閉め
ていく。1600kg/m&sup(2)を保ちつつ、一定の速度でピストンが動くようにす
る
-ピストンが最後まで行くと圧力が0になるのでPressure controlを開ける
-ブザーが鳴ったらBuzzer resetで止めておく
-開ける時は密閉プラグの二カ所の穴から破砕液が飛び出てくる事がよくある
ので注意
-終わったら洗ってMilliQ -> 100%EtOHでwash。使用記録を書く
**dry up
-共通室に装置がある。フタを開けたままエッペンをセットしてPOWER ON ->
コックを奥に90度 五分ぐらい
-終わったらコックを手前に戻す -> POWER OFF
**DDW
DIWの管をタンクに→DIW→水量チェック(SetQで水量変更,DIWで確定)→DIW→
記録をつける
**MilliQ
PUMP ON→量を指定してSTART→PUMP OFF→記録をつける
**CO2ボンベの交換
ボンベ置き場に持って行き交換。レンチは培養室
*プロトコル
**BG11
--(
NaNO&sub(3) 1.5g/L
MgSO&sub(4) 75mg/L
K&sub(2)HPO&sub(4) 39mg/L
CaCl&sub(2)・2H&sub(2)O 38mg/L
Na&sub(2)CO&sub(3) 20mg/L
Citric acid・H&sub(2)O 6mg/L
Ferric ammonium citrate 6mg/L
Na&sub(2)EDTA 1mg/L
A6 (microcomponent) 1mL/L
-------------------------------------------------
:Stock Solution 1
Citric acid 0.3g
Ferric ammonium citrate 0.3g
Na&sub(2)EDTA 0.5g
DDW up to 100mL
:Stock Solution 2
NaNO&sub(3) 30g
K&sub(2)HPO&sub(4) 0.78g
MgSO&sub(4)・7H2O 1.5g (MgSO&sub(4) 0.73g)
DDW up to 1L
:Stock Solution 3
CaCl&sub(2)・2H&sub(2)O 1.9g (CaCl&sub(2) 1.43g)
DDW up to 100mL
:Stock Solution 6 (カビ易いので注意)
Na&sub(2)CO&sub(3) 2g
DDW up to 100mL
--)
-バッファは好熱菌・GT株ではpH8.2
***液体培地
Stock Solution 1 2mL
Stock Solution 2 50mL
Stock Solution 3 2mL
Stock Solution 6 1mL
Arnon A6 1mL
1M TES-KOH (pH 7.8) 20mL
DDW up to 1L
-オートクレーブ後フタは緩めておき、冷めてから締める。
-Stock Solution1は沈殿するので、別にオートクレーブして後から加える。
--TES -> HEPES?(070110)
***プレート
--(
Stock Solution 1 2mL
Stock Solution 2 50mL
Stock Solution 3 2mL
Stock Solution 6 1mL
Arnon A6 1mL
1M TES-KOH (pH 7.8) 20mL
Na&sub(2)S&sub(2)O&sub(3) 3g (Na&
sub(2)S&sub(2)O&sub(3)・5H&sub(2)O 3.7g)
------------------
BactoAgar 15g
1M TES-KOH (pH 7.8) 5mL
DDW up to 1L
--)
-薬剤を塗るときは滅菌水200uL程度で広げる
--薬剤を添加するときはオートクレープ後に加えて混ぜる。こちらの方が均一
に広がって良い
-それぞれを三角フラスコで別にオートクレーブし、後から混ぜてプレートに
注ぐ(1枚20mL)
-シールせず棚に一晩置いておくと水滴がたまらなくて良い
-プレートは場所によって水滴の溜まりやすさが変わるので裏表は経験的に調
整する
-パラフィルムを巻くと生育が悪くなる
**培養
-薬剤は1/1000量(調整済みあり A冷4下)添加。
-綿ろ管は底につけて泡を割らせる。押しつけすぎない。
--本実験用の培養では薬剤は入れない
-時々フォトマルで培養光の強さを調べておく
--doubling timeは8〜10h
--OD&sub(730)=1.0で1×10&sup(8)cells
**PCC6803の形質転換
-OD730=1.0程度の野生株700mLにプラスミドを1uL程度混ぜる
-プレートにピンセットで形質転換用メンブレンを乗せ、細胞を落としてコー
ンラージ棒で塗り広げる
--メンブレンが浮かないように、端に引っかけてずらすようにして敷くとよい
--メンブレンの外に細胞を塗らないように、二回りほど小さめに
-数分乾燥させて一日培養
-薬剤添加培地にメンブレンを載せかえる
-コントロールを設定する場合
--細胞を塗り、プラスミドを1uL程スポットする。フタに位置を記録しておく。
またフタの方向も書いておく
--メンブレンを移し替えるときはフタも移す
-植え継ぎは竹串(シアノ用)でコロニーを拾ってプレートに
-実験に使用する前に数回経代培養
**プライマーの設計
-概ね19bp,GC含量50%前後,末端3塩基でプライマーダイマーを作らない,3'末端
はCかG
-目的以外のものが増えないかBLASTで簡単にチェック。特にシアノバクテリアには、HIP1 (GCGATCGC) という頻出配列があるので、要注意。
-届いたら注文票の濃度を見てTEで0.5mMに調整しストックに
-ストックから10uM 100uLを調製
***TE
Tris-HCl(pH8.0)(ストックあり) 10mM
EDTA 1mM
**ゲノムDNA抽出
-プレートの1/8程度に細胞を塗り広げる
-育った細胞をDW600uLにサスペンド
--openでE.coli用竹串で良い
-軽くピペッティングして、0.1mmジルコンビーズ0.9gを入れた2mLアシストチュー
ブへ移す
-15000rpm 30sec 4°C
-上清を除いて下記を加える
TE 300uL
フェノール・クロロホルム(1:1) 300uL
A冷2 Trisが重層してあるので下層をとる
--そろそろon iceで
-ボルテックス 30sec 3-4回
--一本ずつ、温度が上がるので氷冷をはさみながら。抹茶色になってきたらOK?
-15000rpm 10min 4C
-上清に下記を加えて5min以上置いておく
--(
3M CH&sub(3)COONa 1/10vol
100% EtOH(A冷1) 2 vol
--)
--3M CH3COONa 50uL入れたエッペンに上清500uLを入れてEtOHを1mL加えると良
い
--中間層のタンパクをとらないように、少なめでも良いのでゴミをとらない
-15000rpm 10min 4C
-上清を捨てる
-70% EtOH 2vol(A冷1)でwash
-15000rpm 10min 4C
-上清を捨ててdry up
-30uL RNase/TE(A冷1 ミニプレップ箱)を加え、37Cで1hインキュベート
--時々ボルテックスして沈殿が無くなるように(RNAが分解されるように)
--保存は-20Cに。PCR用ならTEで500倍希釈するぐらいで良い
--きちんと取れてるかは1uLを泳動して確認。未分解のRNAがあれば低分子側に
見える
**segregation check
--ゲノムをとって挿入部位を挟んだプライマーでPCR
**PCR
-氷上で作業
--(
GenomeDNA(Synechocystisの場合：原種DNA x500)(A冷1段 PCR箱) 1uL
10xPCR buffer @Roche(A冷1段 PCR箱) 4uL
dNTPmix(A冷1段 PCR箱) 3.2uL
プライマー 1uLx2
H&sub(2)O 26.8uL
Taqポリメラーゼ(A冷1段 PCR箱) 1uL
(オレンジのシールに無記入)
--)
-まとめて調整し、分注してからプライマーを入れ、最後にTaqポリメラーゼを
入れる
--Taqポリメラーゼは暖めないように。すぐしまう。ストックはC冷3にあるの
で少量分注して使う
-サーマルサイクラー
--スイッチを入れ F3
--AMPLI選択 F2で確認 伸張反応は1分1kが目安
--RUN→HOLDで95℃まで上がったらサンプルをセットしてRUN
95℃ 10min → 95℃ 30sec :熱変性 →
72℃ 10min
54℃(Tmによる) 90sec :アニーリング
〜4℃
72℃ 30sec :伸張反応
×30 cycle
**アガロースゲル電気泳動
-ゲル作製(共用)
agar HT 0.8%
1xTBE 160mL
エチジウムプロマイド 8.4uL
(冷めてから加える)
10xTBE
Tris 108g
Boric Acid 55g
0.5M EDTA(A冷2) 20mL
(EDTA 8.3g)
(溶けにくい・結晶化しやすい)
--ラップで緩くフタをしてレンジで2,3回沸騰させる
---ラップが破裂しないように数カ所穴を開けておくと良い。沸騰したらすぐ
止める
--50℃程度(素手で触れるくらい)に冷めたらエチジウムブロマイドを加えて容
器に注ぐ。黒いラインをコーム側にセット
---泡が入らないように注意。特に下に入るとゲルが浮いてコームが貫通する。
P1000で空気を押し出すと良い
--ゲルを泳動漕の溝にセット、穴が電極側。サンプルを下表のように調整しア
プライ
---サンプルはパラフィルム上で調整すると楽
--PowerON 100V 30min程度 色素が下から3つめのラインに来る程度で止める
,sample 1uL,1kb ladder 10uL
,6xSTOP 1uL
,H&sub(2)O 4uL
---1kb ladder(A冷1段目 ミニプレップ・electrophoresis箱)
---6xSTOP(A冷1段目 ミニプレップ・electrophoresis箱)
**ゲルからの切り出し
-切り出し用のゲルはAgarose Lを使用して作る
---コームの太い側ならウェルに25~30uL程度入る
-Low meltingゲルは50Vで泳動する。1h程
-写真を撮っておく
---UVを当てるとDNAに変異が入るので手早く
-低温室の前のUVランプを使い、スパーテル等で目的のバンドを切ってエッペ
ンへ移す
---1レーンで数十uL。スパーテル2本使うなどして極力ゲルを除くと良い
-切り出したゲルも写真を撮っておく
-切り出したゲルを入れたエッペンをflash遠心してvolumeを確認(ここで250uL
程度とする)
-1vol(250uL) TEを加える
-65C 5min (water bath,ヒートブロック等を使う) 途中数度vortexする
-1vol(500uL) 0.1M Tris-phenol(A冷2)を加えてすぐにvortex
---Trisが重層してあるので下層を取るようにすること
---ice-boxの中にphenolビンを入れて用意しておく。冷えるとゲルが固まり出
すので手早く
-この後すべてのエッペンをさらに暫くvortexする
-15000rpm 10min 4C
-上層をエッペンに取る
---中間の白いのはゲルの成分とかなので極力避ける
--(*)1vol(500uL)のBtOHを加えてvortex
--(*)15000rpm 1~2min 4C
--(*)上層(BtOH)を捨てる
---上層は残すぐらいで良い
-(*)をvolumeが300uL程度になるまで繰り返す(3回程度)
---BtOHで水を少なくして、エタ沈のロスを減らすためなので省略しても良い
-1vol(~300uL)クロロホルム/イソアミルアルコール 24:1(危険物庫) を加えて
vortex
-15000rpm 5min 4C
-上層(~200uL)を新しいエッペンに取る
---最後の方はチップ内で二層になるので下層を捨ててから移せば良い
-1uLグリコーゲン(A冷1ミニプレ箱) を加える
---共沈させる。低分子のDNAに効果的
-1/10 vol(20uL) 3M Na-Acetate (pH4.5) (SDS棚)
-2~2.5vol(400~500uL) 100% EtOH(A冷1)
-vortexしてから-80C冷へ 15min以上
-溶かして、15000rpm 10min 4C
---ここで白い沈殿がそろそろ見えている筈
-ppt 70%EtOHを加えて遠心(15000rpm 10min 4C)
-dry up
-6uLのTEを加える
-37C 20min
-1uL電気泳動して結果を確認
**DNA定量(Nanodrop)
-Nanodrop3.0 -> measurement DNA -> P2でTEを1uLスポットし Baseline ->サンプルを measure で測定
--260/280が1.8以上だと高信頼性らしい。スペクトルは取っておくこと
--print screenかsave record
**LB培地
BactoTripton 1g
YeastExtract 0.5g
NaCl 1g
DDW up to 100mL
-プレートはagar1.5%
**大腸菌凍結保存
60%グリセロール 300uL
培養液 700uL
-80℃
--グリセロールは20%以下程度にすればよい
--使うときは溶かさず竹串でつついて少量取ってすぐに冷凍庫へ戻すこと
**大腸菌形質転換
-BL21(DE3) [-80℃ 上3-左2-2]
-on ice 10min SOC培地・Km準備等
-add plasmid DNA (1uL)
-on ice 30min
-42℃ 45sec heat shock
-on ice 2min
-add 37℃ SOC培地 (450uL)
-37℃ 1h 振とう培養
-選択培地にplating
-37℃ overnight (307B 共通インキュベーター)
-コロニーが育ちすぎないように冷蔵庫に
-プレ培養 プレートを室温に
--凍結保存のストックがある場合はここから
-LB培地(共用) 大量培養の1/100量を滅菌済み三角フラスコに(+薬剤)
-プレートから竹串(E.coli用)でコロニーを拾う(5個ぐらい拾って混ぜちゃう)
-37℃ overnight 振とう培養
-大量培養用LB培地を作っておく。薬剤は粉末で加える
-大量培養はLB培地に 25℃ 10h 振とう培養(130rpm)
-大腸菌用遠心管(500ml)に分けて遠心。5000rpm,4℃,10min
-上清を捨てて沈殿を掻き取って-80℃で保存
--水浴の空焚き注意
--SOC培地はA冷4下 使ったらすぐ冷凍
--大腸菌用KmはA冷4下
--大腸菌用遠心管:HITACHI シアノバクテリア用:Nargen
--器具は熱湯消毒。使用済み培地はオートクレープ後トイレの用具入れの流し
にとか。
--プラスミドの用意、形質転換(+amp)
--発現check、6コロニーで15000rpm,5min、上清と沈殿をSDS-PAGE。場合によっ
ては抗His-tagでウェスタン
--Niカラムで精製。5gぐらいとれる
***大腸菌について
--BL21(DE3):タンパク発現用大腸菌。F-, ompT, hsdSB(rB- mB-), gal(λcI
857, ind1, Sam7, nin5, lacUV5-T7gene1), dcm(DE3) (B株由来)
--BL21(DE3)pLysS:(-80℃1-2-3)リゾチームを少量発現して基底タンパク質発
現量を抑制、毒性タンパク質の発現に。
--JM109:recA1, endA1, gyrA96, thi, hsdR17(rK- mK+), e14- (mcrA-),
supE44, relA1, Δ (lac-proAB)/F'[traD36, proAB+, lac Iq, lacZΔM15]
--JM109(DE3):タンパク発現
--XL10-Gold:(-80℃右奥)Tetr Δ(mcrA)183 Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)173 endA1
supE44 thi-1 recA1 gyrA96
relA1 lac Hte [F´ proAB lacIqZΔM15 Tn10 (Tetr) Tn5 (Kanr) Amy]
***プラスミドについて
-pET:pBR322由来low copyプラスミド。IPTGは入れなくても十分発現するので
入れたり入れなかったりらしい。
**タンパク質の精製
--超遠心機・ローターの予約
--超音波破砕機の冷却(5℃)
-細胞破砕後、タンパク質は常に氷上で冷やす
-カラムの洗浄
--Niカラム(C冷蔵庫2段目)
--下記の順番でカラムを洗浄する
--使用後は空運転させて水を抜く
---Peristaの左側にアダプタがついているのでスイッチはLで
---カラムに空気が入らないようにミリQを流しながら取り付ける
---洗浄液に応じて吸引側のチューブはDWで洗浄する
---Niカラムは容量5mL
,洗浄液,流量(カラム容量に対して)
,MiliQ,2
,2%SDS,3
,25%EtOH,1
,50%EtOH,1
,75%EtOH,1
,100%EtOH,3
,75%EtOH,1
,50%EtOH,1
,25%EtOH,1
,MiliQ,1
,EDTA,3
,MiliQ,2
,100mM NiSO&sub(4)・6H&sub(2)O,2
,MiliQ,2
-BufferA・B,MilliQの脱気
--上記の順に脱気すると洗浄の手間が省ける
--ホースを抜いてからインキュベーターのスイッチを切る
--なるべく泡を立てないように横の穴から容器に移す
-大腸菌の超音波破砕
---シアノバクテリオクロム単離には超音波破砕は不適。フレンチプレスを使用する。
--超音波破砕機をセットしてから循環水のスイッチを入れる。冷えるまで20分程度
---超音波破砕機は100ml程度まで入れられる。留め金のゴムがきちんとセットされているか確認
--BufferA 50mlを入れて(ファルコンチューブで目分量)、そこに大腸菌を入れる。5分溶かしてから懸濁。泡立てない
---大腸菌1gにBufferA 10mlが一応の目安
---遠心管を冷やしておく
--超音波破砕(3min破砕→3min休み 5セット)
---tuningで高音がもっとも出る所に合わせ、levelで180Wに
--破砕液を25mlの遠心管に移す
-破砕液の超遠心 P1000・チップ・BufferA・BufferB・MiliQ・シリンジを低温室に
--低温室でBufferAを入れてバランスを合わせる
--ローターはRP50T-2-161使用 超遠心機にセットしてVacuumを押して真空にする
---HITACHI 55P-72:Vacuumは二段階目(5min程度・表示あり)から回し始めてよい
---CP70MX:Clearでアラームを消しておく。OILはVacuumになると自然に消える。Vacuumはメータの右下のボタンで確認(確認したらすぐ戻すこと)、目印まではいかないので40kなら15-20分程度でよい。立ち上がりが遅いので10分程長めに
--40,000rpm 30min 4℃ Accel・Decel 9
---ローター・遠心機の使用記録をつけ、使用後はDEFボタン(CP70MXはBACK)で乾燥させてから電源を切る
---この間にAKTAPrimeのUVランプを点けておく
--上清を50mLチューブに回収、B bufferを1.5mL(イミダゾール3%になるように)加える
--ペレットにMiliQを8割程度入れて超音波破砕、エッペンにとる
-サンプルループの準備
--黒いゴムが下になるように中の仕切を入れ、下側に水を満たして栓をする。上も同様。泡をなるべく入れない
-AKTAPrimeでタンパク質の分画を行う
--Set parameter→Lamp ON 30分待つ
--Manual run
--吸入口(A・B)をMiliQにセットし、システムの洗浄を行う
---flow rate 2mL/min,B 50%で6mlずつ程度、load,inject,westを洗浄
--injectでflow rate 1mL/minにし、MiliQを流しながらサンプルループをセットする
---水が流れてくる方がサンプルループの上
---アダプタ部分は二段になっているのでケーブルを捻らないように取り付けられる
---吸入口を動かす際は必ずPauseで一時停止すること
--flow rate 2mL/minにし、サンプルループの区切りが下がりきったらLoadに切り替える
--Pauseして吸入口AをA Buffer 吸入口BをB Bufferに。B 3%にする
---キムワイプなどで管が外れないようにおさえる
--flow rate 1mL/minにしてカラムをセット
--水漏れがどこにもないことを確認
--flow rate 2mL/minで平衡化するまで流し、AUをajust zeroでゼロあわせする
---コンドミニマム(塩濃度)が上がらなくなるまで
--Pauseして10mLシリンジを用いてサンプルを注入、サンプルループ内に入っていくことを確認
---残りをcrudeとしてエッペンに少量取っておく
--レコーダーの設定、zeroで零点の設定,Pen Down,10mm/min
---Ajustダイヤルでイミダゾール濃度は1メモリ1%とかにするとよい。
--BufferB 3%,inject,flow rate 1.5mL/minであることを確認してサンプルを流す(start run)
--AUが上がり始めたらflow throughとして50mL程度回収。一部エッペンに。残りは捨ててよい
--サンプルが流れきったらLoadに切り替える
---多少サンプルが残っても良いので、サンプルループ内の泡まで流れないようにする
---装置によってはサンプルが流れきってまだ流し続けると圧力が上がるので注意
--AUが下がりきるまで待つ(5分程度)。
--B 5%に切り替える。5分程度待ち、AUが上がったら回収
--B 10%に切り替える。10分程度待ち、AUが上がったら回収
---ここまでは大体ゴミが出てくる。5%を短め、10%を長めでもよい
---この間にフラクションコレクターにエッペンを並べる。内側から、フタが内側のエッペンの上に重なるようにし、マーカー位置を合わせる
--Set Gradient ON,Set length 90mL,Fraction size 1.5mL,Gradient 10-40%にセット
--ときどき様子を見てエッペンのフタを閉める
--Gradientが40%になったら100%まで上げる
---この間にAUが上がり始めたらまた回収する
--暫く100%で流し、最後に0%に戻す
--Printerでデータを印刷
--MiliQでinject,loadを洗浄。フラクションコレクターは排出口を中央に合わせると捨てられる
---flow rate 2mL/min,B 50%で6mlずつ程度
--Lamp OFF、本体の電源は点けておいてよい
***A buffer (C冷蔵庫一段目)
HEPES(pH 7.5) (1M HEPES C冷2) 20mM
NaCl 100mM
Grycerol 10%(w/v)
-MiliQを使う。広口ビンで用意
***B buffer (C冷蔵庫一段目)
A buffer
イミダゾール (1Mにする)
HCl pH 7.5
-MiliQを使う。広口ビンで用意
**SDS-PAGE
-ゲルの作製
--エタノールでゲル板とコームを拭いて乾かす
--ゴムを食い込ませず、引っ張りすぎないようにして巻く
--100%EtOHやDWで漏れないか確認しても良い。余り濾紙で拭いておくこと
---ゲル板の傾斜が内側に来るように
--Separate gel,Stacking gelを調整,TEMEDのみ注ぐ直前まで入れない
---APSだけなら入れても当分固まらない
--Separate gelをP1000で注ぎ、ブタノールを薄く重層する
---コームの歯より1cm程の高さまで
--15分程度で固まるので(三層に見える)、ブタノールを捨ててDDWで軽く洗い、余り濾紙で拭く
--Stacking gelにTEMEDを入れコームを刺して15分ほど固める
---stacking gelは数mmあれば十分なのでコームは奥まで入れる
--コーム、ゴム、クリップの順で外し、DDWで洗う
--泳動漕を組み立てて1×レムリを注ぐ
,,stacking gel(5%),(3%),Separate gel(5%),(7%),(8%),(10%),(12%),(15%),(17%)
,60%AA,0.17mL,0.1mL,0.66mL,0.93mL,1.07mL,1.3mL,1.6mL,2.0mL,2.26mL
,x8 buffer,,,1.0mL,1.0mL,1.0mL,1.0mL,1.0mL,1.0mL,1.0mL
,x10 buffer,0.2mL,0.2mL,,,,,,,
,dH&sub(2)O,1.63mL,1.70mL,6.34mL,6.7mL,5.93mL,5.7mL,5.4mL,5.0mL,4.7mL
,10% SDS,20uL,20uL,,,,,,,
,10% APS,16uL,16uL,16uL,16uL,16uL,24uL,24uL,24uL,24uL
,TEMED,3uL,3uL,3uL,3uL,3uL,4.7uL,4.7uL,4.7uL,4.7uL
---TEMED:A冷2 APS:A冷1タンパク箱
---ラージゲルは2.5倍量 固まるのに倍時間程度 染色液3倍量
-サンプルの調整
--下表の用に調整
--サンプルをヒートブロックで熱変性、95℃ 3min
---膜貫通タンパクなどは45-55℃ 1hで変性させられる
--遠心機のFlashingでサンプルを落とす
,Sample 10uL,LMW 5uL
,2% DLT 3uL,2% DLT 3uL
,0.25% BPB 2uL,0.25% BPB 2uL
---LMW,DLT,BPBはA冷1タンパク箱
-泳動
--電極を刺してサンプルをアプライ
--POWER ON(MODE C・C(定電流),25mAで80min 10mAで2hが目安)
-染色
--DWで洗ってゲル板を外し、タッパーに入れて固定染色液に漬ける
---ゲル板はスパーテル等で外すが、横側は割れやすいので下から差し込むこと
--浸透機に置き30min
--染色液をCBB用廃液に捨てて、脱色1液・畳んだキムワイプを入れる
--浸透機に置き30min
--脱色1液を捨てて脱色2液を入れる
--浸透機に置きovernight
-ミニゲル乾燥
--乾燥台にろ紙を乗せてDWで湿らせ、その上にゲルを置く
--泡が入らないようにセロファンを乗せ、DWで湿らせながら皺をとる
--ゴム板をかぶせて吸引しながら80℃で二時間程度
--ゴム板をめくってゲルを取り出す
---先に吸引機を止めると逆流することがある。また、なるべくチューブは抜き差ししたくないので
,,固定染色,脱色1,脱色2
,dH&sub(2)O,20mL,30mL,45mL
,酢酸,5mL,5mL,5mL
,,CBB 25mL,MeOH 15mL,
,時間,30min,30min,over night
---LMW調製 LMW(C冷2段目) スクロース(A冷1段目タンパク箱) 説明書の通りに調製、泡立てない
---60%AA ビス(C冷2段目) アクリルアミド(低温室) 湯煎しながらミリQで250mLまでに調整
**ブロッティング
-手袋をすること
-blotting buf 300mL(ミニゲル。ラージゲルは2倍量)
0.531 Borric acid
240mL DW
60mL MeOH (特級)
1.65mL 10%SDS (MeOHの溶解による泡が消えてから、泡立てないように)
-メンブレン:ゲル程度のサイズに切る
--アミノ酸シークエンス用メンブレンあり。(PSQ用)
-ろ紙:メンブレンより一回り大きく、メタノールで拭いた裁断機で切る
--ミニゲルなら10cm×6cm 8枚 ラージゲルなら15cm×16cm 12枚
--ミニゲルの時は12cm×10cmと切って必要な分だけ10cm×6cmに
--タッパーはなるべくCBBで染まってないものを。染まってたらメタノールでよく洗っておく
-ろ紙は3,1,4とずらして置いてblotting bufに浸す
-メンブレンをMeOHに5分間浸す
-blotting bufを入れたタッパーに、ろ紙1枚・ゲル・メンブレンの順に重ねる
-ATTAにろ紙4枚を乗せ、MeOHで拭いた試験管などを転がして空気を抜く
-ろ紙1枚・ゲル・メンブレンをメンブレンが下になるように、ひっくり返して乗せる。空気を抜く
-ろ紙3枚を乗せる。空気を抜く。blotting bufを上から少しかけておく
-電極をセット。定電圧(C・V)で10V 90min
--通電していないと電流量が凄いことになるので見ておくとよい。だんだん下がってくる。
-ゲルの方向と位置・メンブレンの裏表などを、切ったり穴を開けたりしてメンブレンに記す
--ゲルはCBB染色して、きちんとメンブレンに写ってるか確認
**アミノ酸シークエンス
-アミドブラック処理
--乾燥したメンブレンをメタノール処理(5分浸す)
--アミドブラックに浸してすぐにDWで洗う
--スキャナをエタノールで拭いて読み取っておく
***アミドブラック染色液
--(
CH&sub(3)COOH 10%
MeOH 50%
DW 40%
アミドブラック 0.1%(w/v)
--)
-アミノ酸シークエンサー
--エタノールで拭いたカッターと定規でメンブレンのバンドを5mm×2 6-7mm×1 程度に切って試料とする
--スキャンしたメンブレンのコピーに切った部分を記す
--以下PPSQ-21用簡易マニュアル参照 読むのは10残基程度
**BN-PAGE
-Blue-Native PAGE Methods (Schägger et al. 1991 vol. 199 page 223-231. Anal. Biochem.)
--Stock solution
|Solution|Composition|
|Deep blue cathode buffer|50 mM Tricine, 7.5 mM imidazole, 0.02% Comassie blue G250|
|Slightly blue cathode buffer|50 mM Tricine, 7.5 mM imidazole, 0.002% Comassie blue G250|
|Anode buffer|25 mM imidazole/HCl (pH 7.0)|
|Gel buffer|75 mM imidazole/HCl (pH 7.0), 1.5 M 6-aminocaproic acid|
|AB-mix (49.5% T, 3% C)|48 g acrylamide, 1.5 g bisacrylamide per 100 mL|
|5% Comassie blue G250|Suspended in 500 mM 6-aminocaproic acid|
--Gradient gel preparation
||stacking|stacking||separate|separate|separate|
||3% T|4% T||3% T|5% T|13% T|
|AB-mix|0.18 mL|0.25 mL||0.55 mL|0.94 mL|1.95 mL|
|Gel buffer|1 mL|1 mL||3 mL|3 mL|2.5 mL|
|Glycerol||||||1.5 g|
|Water|1.82 mL|1.75 mL||5.4 mL|5 mL|1.5 mL|
|Total|3 mL|3 mL||9 mL|9 mL|7.5 mL|
分離ゲルは、3% T or 5% Tを3.99 mL、13% Tを3.33 mL分取し、3% or 5% T-13% Tの直線的濃度勾配のミニゲルを作る。分離ゲルの濃度は、分子量のレンジが50-10,000 kDaの時は3% Tを使い、この時のstacking濃度は3% T。50-1,000 kDaの時は5% Tを使い、stackingは4% Tを使う。
--Mini gel preparation
||stacking|stacking||separate|separate|separate|
||3% T|4% T||3% T|5% T|13% T|
|Total|3 mL|3 mL||3.99 mL|3.99 mL|3.33 mL|
|10% APS|25 µL|22 µL||22.1 µL|20 µL|16.6 µL|
|TEMED|2.5 µL|2.2 µL||2.2 µL|2 µL|1.6 µL|
ゲル作製時はペリスタポンプの速度を目盛り4に設定し、スターラーの速度は目盛りの8から5まで順次下げながら撹拌速度が一定になるようにする。分離ゲルが全部流れたら、水飽和ブタノール（上層）をそっと重層する。ゲルは1~2時間で固まるはず。分離ゲルが固まったら、ブタノールを捨て、stackingの液（APS, TEMEDを加えたもの）で素早くゲルをすすいでからstackingを流す。コームをさして静置。ゲルが完成したら4°Cに冷やしておく（前日に作製することをおすすめします）。
--泳動
---泳動は全て4°Cで行う。
--準備
---大きめのビーカー（プラスチック）、10 mL 駒込ピペットまたは代わりになるもの、泳動層、電極（30 min前までに低温室に持って行き、電源をつけておく。）、プラグ、ピペットマン、チップ。Bufferはあらかじめ4°Cにしておく（4°Cで保存しておいても良い。CBBが溶出することもあるかも。）。
--サンプルロード
---サンプルは6 µg Chl a/レーンくらいがよい。(光化学系複合体の場合)
---ゲルからコームを外し、Deep blue cathode bufferで一度洗い、もう一度ウェルにDeep blue cathode bufferを入れておく。
---ゲルを泳動層にセットし、サンプルをロードする。（この時cathode bufferは入れない。）
---サンプルをロードしたら、cathode bufferをそっと入れる（サンプルが乱れないようにする）。
---電流、電圧は、サンプルがstackingを泳動している間は50 Vで行い、分離ゲルに入ったら250 Vまたは7.5 mAに調製する（どちらか小さい方に調製）。
---サンプルの先端が分離ゲルの上から３分の１に到達したら、陰極側のbufferをDeep blue cathode bufferからSlightly blue cathode bufferに交換する。
---泳動時間は約4時間ほどで終わると思う。
---分子量マーカーはHMWのゲルろ過用を用いた。
**Bradford法によるタンパク質の定量
-BSA標準溶液(2mg/mL)(C冷2)を希釈 検量線用の希釈系列を作る (0.75-0.125mg/mL程度)
--検量線用BSAは調製後、個人で-20℃冷蔵庫に入れておく
-測定試薬 Bio-Rad ProteinAssay(C冷2) を5倍希釈して使用
--チューブが染まるので、CBB希釈用として個人で持っておく
-20uLタンパク質に測定試薬を1mL加える
--0mLサンプルはMiliQ20uL。標準・試料同時に行う
-3分間ボルテックスにかける
--3-5分で任意。ただし長いと吸光度が1を超えやすくなるので短めがよい
-595nmの吸光度を薄いものから測る
--MiliQで零点。経時的に吸光度が上がっていくのでなるべく手早く。測定はパスツールピペットを使うと良い
--近似曲線のR^2の値が1に近い程良いが、吸光度0.8あたりから線は寝てくる
**透析
-手袋をすること
--透析チューブを適当な長さに切り、DWに付けてレンジで温める。5min程度
--チューブの中までDWで洗う。これを三回繰り返す
--低温室へ。ビーカー、スターラーバー、透析クリップ、はさみ、P1000、チップ
--チューブの片側を二回ほど結んで余りを切る
-EDTA処理
--1mM EDTAを加えて一時間整地
--0.5M EDTA:A冷2段目扉裏
**プルダウンアッセイ
--シアノFTはアルミで遮光して保存しておいた方がよいかも
-準備
--電気泳動用試料として、精製His-tag付きタンパク質・シアノバクテリアのflowthroughをエッペンにとっておく
--精製His-tag付きタンパク質、オープンカラム1mL
--MiliQ 10mL→イミダゾール濃度30mM buffer10mLで平衡化
--シアノバクテリアのflowthrough 25mLを超遠心 40k,4℃,30min
---Peristaはカラムの下部に取り付けて吸引
---もう一本のチューブでカラムへアプライ
-protein binding
--タンパク質をイミダゾール濃度が30mMになるよう希釈
--Peristaでタンパク質を流し、カラムに結合させる→電気泳動用に回収
--イミダゾール濃度30mM buffer10mL程度でwash→電気泳動用に回収
--PeristaでシアノFTを循環させる。overnight→循環終了後、電気泳動用に回収
---後ろの締め付けネジを微調整して流量をあわせ、カラム内は常に一定の液量が保たれているようにすること
---カラム直下にチューブを置いておく等、チューブの脱離・カラムの液溢れ対策はしておいた方が良いかも
--イミダゾール濃度30mM buffer10mL程度でwash→電気泳動用に回収
--イミダゾール濃度を1Mにして回収
---水に浮きやすいタンパク質があるので、washはカラムぎりぎりまで通してから
-分析
--電気泳動後、FMBIOでフィコシアニンのバンドを同定しておく
**ゲルシフトアッセイ Electrophoretic mobility shift assay(EMSA)
-泳動ゲルの作製
--以下の溶液でラージゲルを作る
60%アクリルアミド/1.6%ビスアクリルアミド 2.3mL
1xTBE 20.6mL
10% APS 76.6uL
TEMED 23uL
---TEMEDはゲル板に流し込む直前に加える
---いっぱいまで流し込んでコームを刺す
---固まりにくいので前日に作っておく。37C 1hに置いたり、アクリルアミドを脱気したりしても良いらしいがやったことはない。固まる前に低温室に置かない。
-ラージゲル乾燥用濾紙・セロハンを切っておく
--TBE・ろ紙・セロハン・サンプル(DNA,タンパク質)・泳動ゲル・RIカード・
USBメモリー
-プローブの標識
---water bathの用意
--以下の溶液をエッペンに入れる。[γ&sup(32P)]-ATPは最後に加える
---ピペッティング・ボルテックスはせずに指で弾く程度が良い
**DNA (例えば250bp,65ng/uLなら1~3uL)
10x kinase buffer(RI冷1右扉裏) 5uL
[γ&sup(32P)]-ATP 5uL
T4 polynucleotide kinase(RI冷1右扉裏)(最後に入れる) 2uL(20U)
H&sub(2)O up to 50uL
---DNAは全量100uL(プロトコルの3倍量)でPCR -> 20uLずつ5レーンに流して切り出しで十分取れる
---[γ&sup(32P)]-ATPはアマシャムのredivue品 9.25MBq(AA0068)を使用
--37C 30min 酵素反応
---この間にヒートブロックを75Cにし、カラムの準備、電気泳動のプレランもしておいて良いかも
--75C 5min 酵素を失活させる
-カラムの準備
--nap5 脱塩カラムをスタンドにセットしバイアル瓶を廃液受けにする。上下のふたを取って中の液体をすべて流し出す
---カラムの高さは適当に調節、高すぎると出てきた液体が跳ねるので注意
--緩衝液10mLをカラムに流す
緩衝液
NaCl 80mM
Tris-HCl 50mM
--完全に液体が流れ落ちる前に下のフタをして、プローブの標識が終わるまで置いておく
-プローブの精製
--エッペンを10本フタを開けて並べておく
--カラムから緩衝液をすべて流し出し、標識したプローブをカラム内のゲルの上に入れる
---色が付いているので見てわかる。完全にゲル内に入るまで待つ
--450uLの緩衝液をカラムに入れて液体が完全に落ちきるまで待つ
--カラム直下に用意しておいたエッペンを置く
--各100uLの緩衝液をカラムに入れる→2-3滴の液体をエッペンに取る。この操作を10本分行う
---カラムが高すぎると液が跳ねるので注意
---概ね3-5番にピークが来る。サーベイメータに近づける事である程度のあたりはつけられる
--エッペンを軽く弾いてからflash遠心で液を落とす
--シンチレーションカウンター用のバイアル瓶にエッペンを入れ、そこに1uLずつ取ってシンチレーションカウンターでβ線を測定する
--手前側のピークのエッペンを実験に用いる。前後のエッペンも取って置く。スポット用に前後の弱めのを持っておいても良い
---貯蔵庫の-20Cで保管
-プローブとタンパク質の結合
--例えば以下のような組成で液を混ぜ、15~30min 室温でおいておく。標識プローブを入れてからタンパク質を入れる
--軽く遠心して室温で15~30min静置
,タンパク質(ug),4xバッファー(uL),H&sub(2)O,標識プローブ,coldプローブ
,0,4,up to 16uL,1uL,0
,0.25,4,up to 16uL,1uL,0
,0.5,4,up to 16uL,1uL,0
,1,4,up to 16uL,1uL,0
,0.25,4,up to 16uL,1uL,適量(Hotの100~400倍)
,0.5,4,up to 16uL,1uL,適量(Hotの100~400倍)
,1,4,up to 16uL,1uL,適量(Hotの100~400倍)
---coldプローブはHotの標識に使った量をそのまま入れても良い(精製時で100倍以上に希釈されているため)
---バッファーの組成はタンパク質による、以下に例示
HEPES-NaOH 10mM
NaCl 50mM
EDTA 1mM
DTT 1mM
glycerol 10%(v/v)
poly dI-dC 10ug/mL
BSA 1ug/mL
4x バッファー調整例
1M HEPES-NaOH(C冷2) 10uL
1M NaCl 10uL
0.1M EDTA(0.5M A冷2) 2uL
0.1M DTT(1M A冷1 ミニプレ箱) 2uL
glycerol 20uL
poly dI-dC(A冷1右扉裏) 10uL
0.1mg/mL BSA(10mg/mL A冷1タンパク箱) 2uL
DW up to 50uL
--6xSTOP(RI冷2)を泳動度の目安として用意
-電気泳動
--1xTBE緩衝液とゲル板を泳動漕にセット
--ウェルをピペットですすぐ
--CV 20mAで1h prerun
--サンプルをアプライしてCV 20mAで1h泳動する
---サンプルは無色なのでマジックでレーンに番号を振るなどしておくとどこまでアプライしたかを見失いにくい
---最近接触が悪いのか、きちんと流れていない事があるので注意
---6xSTOPの青い色素が半分程度まで流れるぐらい
---ゲル板で遮蔽されるのでこの時は遮蔽板は不要
--流しでゲル板を外す
---泳動バッファーにはほとんど放射能は残らないはず。流す前にサーベイしておく
--スパーテル等でゲル板を開けて裏側に濾紙を乗せる
--ゲル乾燥機に2枚ほど濾紙を乗せて、その上にゲルが上になるようにゲルと濾紙を乗せて、セロハンをかぶせて乾燥 2h
---濾紙の上に弱いRIをスポットしておくと目印になる
---きちんと吸引されているか確認
---この間にIPを消去しておく
---終わったらゲル乾燥機を汚染していないかチェックしておく
--使用記録を書く
-放射線検出
--IPを消去。消去器に白い面が露光されるようにセットして20~30min
--乾燥したゲルをIPと一緒にカセットにセットする。IPの白い面がゲル側に来るように
---重しを乗せるなどして密着するように要工夫
---IPは濡らすと使えなくなるので注意
--露光 RIの強さにより10min~over night
--BAS-2500の起動。初期化に10min程かかる
---フタを閉めるときに"プシュッ"となればきちんと閉まっている。きちんと閉まっていないと初期化が終わらないので注意
---多めに当てておくとバックグラウンドが減るが、当てすぎると定量性が失われるので注意
---RI到着直後なら10minでおおざっぱに見える。30~240min程度
--DarkでIPを白い面を上にしてBAS-2500にセット
--Image Reader -> Gradation 16bit,resolution 50,sampling area 設定 ->Read
--画像が出たらOK -> Export File -> TIFF
--MOかUSBメモリーで持ち出し
---未使用時はカセットを開けておく
---使用後のゲルは保管廃棄室の棚へ
**濁度(OD730)
-OD730=1で1×10^8Cellsになるように補正式あり [OD730修正用.xls]
**クロロフィル量の測定
+遠心(15000rpm,3min)
+上清を捨ててメタノールを加える
+ソニケーション。沈殿が見られなくなるまで
+遠心(15000rpm,3min)
+OD665×13.4がクロロフィル量(ug/mL)
**吸収スペクトル
--鍵(15-B07)・P1000・DW・ブラックセル・FD・試料(OD730=2.0に調製 1mL程度)
--分光光度計(U-3500)で測定。350〜800nmの範囲、エンドオン型フォトマル装着、細胞の吸収スペクトル測定に適している
-分光光度計(U-3500)
-電源ON
-スペクトル測定を選択
-安定化(10min)
-黒いカバーを外す
-測定条件設定→測定→ユーザー1設定
-ブランクを入れてユーザー1ベースライン測定
-試料測定
-(a:\uv40\spectrum\)保存・変換→FD
--保存せず、変換で保存先に直接FDを選択してもOK
-電源OFF
-PC,Chl量計算のため試料のOD730をUV-2400PCで測る。
--2ビーム透過型分光光度計。溶液や薄膜試料に最適。散乱の大きい試料の測定に良いらしい。
**低温吸収/蛍光スペクトル
-液体窒素・鍵・P200・DW・試料(chl 5ug/mlに調製 200uL)・タイマー・アルミホイル・FD
--試料を調整するときは遠心時に冷やさないように注意
-RF-5300PCで測定する。フォルダを入れ替えてフタをはめてLN2を入れる。キュ
ベットも冷やしておく
-2時間冷却待ち
-測定器とPCの電源ON,PCでRF-5300PC起動
-設定→PC設定→COMポート(1)選択。保存先・変換保存先も入力しておくと楽
-設定→装置設定→照明ON
-試料を入れるトコだけトイレの水道で溶かす
-試料を入れてアルミを巻いて暗幕かけて10分待つ
-アルミ巻いたままLN2で冷却
-アルミ剥がしてセット、620〜800nmで測定。範囲は150程度。励起バンド幅10nm蛍光バンド幅5nm、クロロフィルは435nm、フィコシアニンは600nmの吸収を見る。リピートスキャン10回。シャッターは検出器を保護するために測定時以外はOFFに
-ファイルをチャンネルに開いて変換→FD
-電源OFF、フォルダを戻しておく。
--何も出ない時はバンド幅を変えて一回測定してみると良い
--バンド幅は回折格子からのスリットの幅、上げると見辛かったピークが出る事も
--キュベットは常に同じ物を使う(落書きあり使用)
--90°では散乱が大きすぎるので少しずらした所にセット(印あり)。
成川
-励起スペクトル
--励起光の波長を変えてのスキャン。検出範囲は測定光より長波長より設定すること
--連続測定キャンセルで測定後に名前を聞かれる
**BLAST検索
+NCBI→BLAST→Genomes→(Microbes)→配列をペースト、サーチする生物種を選んでBLAST
+配列のアライメント。clustalxを用いる。
+結果をBioEditなどで整える。NJTreeなんかで系統樹も描ける。
-Sequence Retrievalをチェックしておくと、結果で出てきた配列を再検索してFESTA形式に出来る。
-ゲノムサイズが違いすぎて、pBLASTのスコアの低い蛋白質も、SMARTなんかでドメインで比較なんてすると関係あったりするかも。
-annotationは元の論文を見てみないとどこまで信用出来るかは不明。
