Phyto@Wiki

Protocols

2007-10-15T11:39:14+09:00

使用後の実験器具は直ちに片付けること ---- DNA抽出法 Phenole/Chloroforme法 -18 Samples (x19) 海水を1-2L濾過したフィルターを1.5mLチューブに移す ↓ [物理破壊] TE 260mLをそれぞれ加え、ペッスルでフィルターをすりつぶす。(フィルターは砕けない・・・。) ↓ [タンパク分解;ProteaseK] TE 200µL,SDS 30µL, ProteaseK 3µLを加え、37℃で1hインキュベート premix (TE 3.8mL+SDS 0.57mL)から230µL ↓ [細胞壁破壊;凍結融解] 凍結(-80℃)と融解(37℃)を3回繰り返す ----------------------> -80℃で保存可能 ↓ [タンパク凝縮;CTAB] 5M NaCl 100µL, CTAB 80µLを加え65℃で10minインキュベート premix (NaCl 1.9mL+CTAB 1.52mL)から180µL ↓ [タンパク質除去;フェノール/クロロホルム抽出] PCIx2,CIA(780µL) ↓ [DNA精製;イソプロパノール/エタノール沈殿] IP,EtOH(780µL) 70%EtOH沈殿(780µL) TE 57µLに溶かす ↓ [抽出の確認;Agarose gel EP] 5µLを1.5% agarose gelで確認 ↓ [濃度計測] 2µLを吸光光度計で濃度計測 ↓ [濃度を揃える] 適当な濃度になるようにTEを加える 5本に分注して-80℃で保存(ラベルは白) Quantification of nucleic acids - using UV absorbance at 260 nm, with an absorbance of 1 corresponding to 100 mg of DNA par litter according to equipmet's manual - equipmet : Genequant TM (Amersham Pharmacia) with ultramicrocell (5 µl) - 簡単、且つ小ボリュームでDNAを計測できる利点がある [サンプルの準備] 吸光度の計測範囲内の濃度にDNA濃度に希釈する - 具体的には吸光度(Absorbance)で0.XXX - 0.0XX(%) - 注意点1;セルの容積が小さいため、計測値がばらつくことがあるので共洗いが必要である - 注意点2;セルは高価なので、計測面の傷や落下などによる破損に気をつける - 注意点3;セルの計測面は汚れがつかないように注意する。汚れた場合は”眼鏡拭き”で拭き取る - 主に"Gene quantの取扱説明書"参照 - 本プロトコルでは -> 「subsample 2 µl of the DNA solution -> dilute the subsample into x10 with the dilution buffer (TE, 18 µl)」の合計20µLを用意 ↓ [バックグラウンドの設定] エタノールからウルトラマイクロセルを取り出して乾かし、セル内を洗浄。 [[[洗浄手順]]] - セル内に溶液や空気を通すときは、同じ方向(穴)から通すと、計測誤差が減る 1. セル内の水滴やホコリを空気で飛ばす(air wash) 2. DNAを溶かしているバッファー(c.a.100µL)でピペッティングし、水滴をAir wash(このとき、反対側をキムワイプで受けておく) 3. バッファー(c.a. 70µL)を通しair washを1-2回行う [[[]]] ↓ バッファー(5-7µL)を空気が入らないように注意してセルに満たす - 空気が入っているかどうかのチェックは”黒”を用いてチェックできる(きれいな”円”が見えることを確認する) ↓ "set reference"ボタンを押し、"ピーッ"と音が鳴ったら向きに気をつけてセルを入れる -「"o"の面を手前にする」など、向きを毎回揃えるとばらつきが減る ↓ 音が鳴ったらセルを素早く取り出す ↓ バックグラウンドの計測完了 [サンプル計測] セルを[[[洗浄]]]し、サンプル6µL入れた後、air wash(共洗い) ↓ 再度、サンプル6µLをセルに入れ計測 ↓ [[[計測]]] 1. "Sample"ボタンを押し、1回音が鳴ると、直ちにセルをセットする 2. 音が鳴ると、セルを直ちに取り出す 3. 計測された吸光度(absorbance)を記録する 4. "select"ボタンで、230、260、280、320nmの吸光度を表示し記録する [[[]]] ↓ [サンプル計測->計測]を繰り返し ↓ 洗浄 ↓ スイッチoff [DNA量の見積もり] - 260nmの吸光度(A260)は"x 100[ng/µL]"と換算することができる - "A260 x 50[ng/µL]"とする本が多いが、本マイクロセルを用いた場合、は以上のようになる - 10倍希釈溶液を用いた場合、"吸光度 x1000"(つまり、表示吸光度値の"0."以下をそのまま)を元のサンプルの濃度とすることができる。 Agarose Electrophresis checking for PCR products consentration - 1.5% (g/ml TE) Agarose [condition] - PCR products ... 2µL each - Marker 100 bp ... 0.5 µL - 40 - 50 min, 100V ↓ [staining] EtBr (100µL·EtBr/200mL·dH2O) ↓ 15 min staining dH2O ↓ 15 min destaining [photo] photograph with desital camera (mode=Av, F=8.0(minimum),ISO=400) [mesurment] Gel-Pro Analyzer(R) Version 4.5 for Windows (TM), 1-demention analysis mode DGGE (Denaturing Gradient Gel Electorophoresis) #ref(http://www15.atwiki.jp/ziken?cmd=upload&act=open&pageid=4&file=DSCN4943_1_tools.png) -実験器具は全て実験台の引き出しに保管。使用後は直ちに元の場所に戻すこと [ゲル作成] <ガラス板の洗浄> 洗剤→蒸留水で洗浄し、ゲル片や洗剤を取り除く ↓ 100%エタノールでガラス表面、スペーサーも拭く(写真A) ↓ スペーサーを挟んだ大小のガラス板をサンドイッチクランプに取り付ける(ガラス板ユニット) -ガラス板底辺からスペーサーガ出過ぎないように気をつける -パラフィルムを貼付けてゲル漏れを防ぐ(写真B) ↓ ゲル作成用スタンドにガスケットを敷き、ガラス板ユニットをセットする -つまみを倒してスタンドにゲル板が固定されたのを確かめる(写真C) -ゲルを流し込むためのチューブをビニールテープで付ける #ref(http://www15.atwiki.jp/ziken?cmd=upload&act=open&pageid=4&file=MakingGELL.png) <ゲル試薬の調整> -80%DN(6%AA)と0%DN(6%AA)の2種類のストックAA溶液を混ぜ合わせて、各実験用に「濃いDNAA溶液(HAA)」と「薄いDNAA溶液(LAA)」を作成する -HAAとLAAをgradient maker(BioRad)で混ぜ合わせて、LAA%からHAA%の濃度勾配の付いたAAゲルを作成する次式から、LAAとHAAに必要な80%AA(6%)の体積を算出する式 ; a x (X/80) a = ゲルの体積/2 X = 作成したいLAA or HAAの濃度(%) 16 cm x 16 cm x 1mmゲルの場合、容積は32mL 分配を&u(){gradient部分=26mL},&u(){stacking部分3mL}とする(残りはコームの体積) a = 26/2 = 13 HAA=25%,LAA=75%とするなら、必要な80%AAは HAA; X = 13 x (75/80) = 11.375 mL (必要な0%AAの体積は、13 - 11.375 = 1.625) LAA; X = 13 x (25/80) = 4.0625 mL (必要な0%AAの体積は、13 - 4.0625 = 8.9375) <> |BGCOLOR(White):CENTER:13mL|BGCOLOR(LightBlue):CENTER: 25 |BGCOLOR(SteelBlue):CENTER: 70 |BGCOLOR(Beige):CENTER:stacking| | |BGCOLOR(LightBlue):CENTER: 0%AA|BGCOLOR(LightBlue):CENTER: 8.9375|BGCOLOR(SteelBlue):CENTER:1.625 |BGCOLOR(Beige):CENTER:3| | |BGCOLOR(SteelBlue):CENTER:80%AA|BGCOLOR(LightBlue):CENTER:4.0625|BGCOLOR(SteelBlue):CENTER:11.375|BGCOLOR(Beige):CENTER:0| | |BGCOLOR(Salmon):CENTER:APS |BGCOLOR(Pink):CENTER: 80 |BGCOLOR(Pink):CENTER: 80 |BGCOLOR(Pink):CENTER:18|(µL)| |BGCOLOR(Salmon):CENTER:TEMED|BGCOLOR(Pink):CENTER: 16.25 |BGCOLOR(Pink):CENTER: 16.25|BGCOLOR(Pink):CENTER:4.5|(µL)| -TEMEDとAPSは薄いと、ゲルの上部が固まらずに蒸発してしまうため、wellが小さくなる。 -逆に多すぎると、作成中にゲルが固まる ↓ 50mLチューブに必要なHAAとLAAを作成する -HAAに色素(xylencianole)を約10µL入れると作成したゲルの濃度勾配が分かりやすい ↓ Stacking gel 用に0%DN溶液を3mLとる ↓ APS(ammoniumparsulfate;10mg/mL)を"HAAとLAAの[80µL;体積 x 5µL]"加え、vortexする -なるべく冷やしておく(冷蔵室へ) -stacking gel用DNAA溶液にもAPSを、同じ割合か少し多め加える[18µL;体積 x 6µL] ↓ TEMEDを"HAAとLAAの[16.25µL;体積 x 1.25µL]"加え、vortexする -ここから先はゲルが固まり始めるので、高温を避けて無駄無く操作する ↓ シリンジにLAAとHAAをとる ↓ gel makerにセットし、シリンジのチューブをゲル板に取り付けたチューブとつなぐ -シリンジとチューブに気泡が入らないように注意し、シリンジとつながっているチューブの先まで溶液を満たしておく ↓ 均一な速度でgel makerを操作してゲル板にAA溶液を流し込む -使用後、直ちに蒸留水でシリンジを洗浄する(管内でAAが固まると次回から正しい濃度勾配を造れなくなる)。 ↓ ゲル上部の空いたスペースにコームを差し込み、stacking用AA溶液にTEMEDを加えて1mLピペットでゲル上部に静かに流し込む ↓ 4時間以上室温におきゲルを固める [DGGE泳動] <サンプルアプライ> コームを抜きウェルを洗浄する -泳動バッファー(TAE)をシリンジに満たして洗浄する ↓ コアユニットにコア用ガスケットを取り付ける -ガスケットを忘れるとガラス板が割れるので注意 ↓ 洗浄したガラス板をコアユニットに取り付ける - 一枚でDGGEを行う場合は同様にダミーガラス板をセットする ↓ コアユニットの向きに注意して泳動層にセットし、約15分間温める -flowスイッチもonにしてコアユニット上部に泳動バッファーが溜まることを確認 -溜まらなければガスケットとガラス板を付け直す ↓ サンプルをウェルにアプライして泳動開始(4〜16時間) ↓ 赤黒コネクターをパワーサプライに差し込み、電圧を▽△ボタンでセット後、startを押す -コアユニット上部にの白金線がバッファーに浸からないとエラー(Err09)となる -その他のエラーは取説参照 [染色&記録保存] 染色液を作成し暗所に保存 - 染色液; dH2O 80mL + SYBERgold 2µL -水道水は染色効率が悪くなることがあるので使わない ↓ パワーサプライのスイッチをoffにし、赤黒コネクターを抜く ↓ コアユニットを取り出し、ガラス板ユニットを外す ↓ サンプルの順に注意してサンドイッチクランプからガラス板を取り外す ↓ スペーサーとガラス板を外す -ガラス板を外す際は"ガラス板分離器"を使用しても良い ↓ ゲルの不要な部分(ウェル部分)を切り取り、表裏とサンプル位置が分かるように目印をつける - 例) 右上端をカット ↓ 染色液に浸け暗所で約20分間インキュベートする -染色している間に機材を洗浄する ↓ dH2Oに約20分間浸けて余分な染色液を洗い流す ↓ トランスイルミネーターにサランラップを敷く ↓ サンプルの向きに注意してゲルをトランスイルミネーターにおく -ゲルとラップの間に気泡が入らないように注意する

DGGE for psbA

2007-10-10T14:03:37+09:00

他のページへ [[実験ノートへ戻る>実験ノート]] [[Protocols>Protocols]] [[Procedure>Procedure]] [[トップページ>トップページ]] [[メニュー>メニュー]] ---- メモ AgaroseGel hight = 120 mm @ 36 ppi DGGE Gel hight = 280 mm @ 36 ppi ---- 071002; psbAプライマーを使ったDGGE解析の条件検討 &u(){Reference} -不明 &u(){Protocole} -不明 &u(){Condition} -不明 &u(){Samples} -KH0605,1-9(Stn. .......) DGGE image #ref(071002_DGGE_rsa.jpg) &u(){Comment;Kataoka} [バンドA;赤色] -Aで示した3本のバンド(赤色)は目的の2本鎖DNAではない可能性がある。1本差DNAと考えられる。これは、長時間の電気泳動したときにこのバンドの停止位置が変性剤濃度によらないことから確認済。 [バンドB;青色(一部)] -ウェルのかたちを反映したバンドの形状からしてこちらも、目的のDNAかどうかは不明。 [バンドC;緑色(一部)] -このバンドが目的のバンド。 Cyanobacteriaのプライマーセット(CYA351-CYA781)で得られたパターンと類似している。得られる塩基配列に期待が持てる。ただし、(1)バンド位置がゲルの上部に偏っていること、(2)バンドが太いことに関して検討が必要。 [対策] (1) 一番最初の条件検討としては変性剤濃度勾配の幅が狭い。0-50%の濃度幅で試すことが必要。 (2) (1)を行うことで解決する可能性がある。全体的にバンドがシャープではなく、バックグラウンドが高い。 -下記のPCR産物のAGP(Agarose Gel Electrophoresis)のバンドの濃さから考えて過剰にapplyされているためにDGGEに最適な解像度が得られていないと考えられる。AGEの濃さと16µLと言うことから考えて(600ng以上かも知れない...)、DGGEの解像度を得るには過剰である。apply量が多い場合にDGGEの解像度が悪くなる例は下記の参考実験を参照。 -AGEの画像解析からPCR産物のDNA濃度(ng/µL)を推定し、段階的に希釈したPCR産物でDGGEを行うことで最適なapply量を決定できる。 -非特異的に増幅されたPCR産物(特に750bp以上の断片)がDGGEのゲル上部のスメアの原因 AGE check #ref(20071002_PCR.jpg) &u(){Condition} -1xTAE,Aga=1.5%,time=40min,Et-Br,stain=30min,destain=10min -photo; degital camera(filter=UV&red,mode=AE, Tv=1, Av=8.0, 測光方式=評価測光, ISO=400, 焦点距離=5.4mm) &u(){Samples} -KH0605,1-9(Stn. ...不明...),2µL each -Marker=1µL each &u(){Comment;Kataoka} 増幅されたバンドについて -750bpの位置にバンドがあるので目的のpsbA遺伝子領域を増幅できていると考える。 -750bp以上の増幅が大きいことから、PCRによるartifactの増幅が多い。バンドの濃さについて -マーカーと比較して750bpのバンドが太く濃いことから、PCRによる増幅は飽和していると考えられる。また、ゲル最下部のプライマによる陰が僕の経験と比べても濃いように思う。以上のことから、genomeにprimerが着く反応に加えて、genomeもしくは増幅されたPCR産物のprimerサイト同士が着くことでartifactを形成しているかも知れない。 [対策] 750bp以上のサイズの非特異増幅産物が見られること。750bpバンドが濃い(太い)ことから考えてPCRによる増幅は過剰であると考えられる。 -非得意的な増幅を避けるために、PCRサイクル数を減少させることで750bp以上のサイズのバンドが減少することが期待できる。 (Ishii and Fukui 2001; Applied and Environmental microbiology 2001 p3753-3755) 過剰のprimerが残存しているがDGGEへの影響は不明。もしかしたら過剰のprimerはPCR反応中にartifactの原因となるかもしれない。(ただし、推測の域を出ない) -primerの量を減らすことでartifactの可能性を減らすことができる。 -anniling温度を下げることでprimerのannilingが相対的に増加し、目的の遺伝子部位を増幅する効率が上がるかもしれない。 ---- 参考データ(operated by Tak) #ref(20060909_1_LR.jpg) 変性剤能動勾配によってバンド位置の決まらない1本鎖DNAと思われるバンドのDGGE中での動き。 -1〜8時間、時間差でDGGEをすると赤矢印以外のバンドは最適な変性剤濃度勾配の位置で停止するが、このバンドは止まらない。 (primer=EUB341F-GC-907R,25-45%DN,6%AA) #ref(20070314_1189_apply_5.jpg) DGGEにapplyするDNAの質量(ng)によるバンドの見え方の違い。 -400ngのレーンAは濃く太いバンドが見られる。現れた他のバンドも太くバックグラウンドも高い。 -150-75ngに最適値がある。50ng以下ではバンドとして検出されないものの方が大きくなる。レーンB〜Dは同一サンプル、レーンAのみ異なるサンプル。 (primer=EUB341F-GC-907R,6%AA) 071004; PCR conditionの検討 [psbAプライマーを使ったDGGE解析の条件検討] 目的 -PCR conditionを変更して、DGGEに最適なPCR産物を得る。 -071002と比較して、condition変更の成果を確かめる。 &u(){Condition変更点} -不明 AGE check #ref(20071004_PCR.jpg) &u(){Condition} -1xTAE,Aga=1.5%,&u(){time=40min},Et-Br,stain=30min,destain=10min -photo; degital camera(filter=UV&red,mode=AE, Tv=1, Av=8.0, 測光方式=評価測光, ISO=400, 焦点距離=5.4mm) &u(){Samples} -KH0605,1-9(Stn. ...不明...),2µL each -左から、071004PCRed{No.2,4,6,8,10,12,14,16,18},M,071002PCRed{No.2,4,6} -Marker=1µL each &u(){Comment;Kataoka} -PCR conditionを変更することで、071001?(右、3 lane)と比べて、鮮明なバンドパターンが得られるようになった(lane2,4,10,12,14,18)。 -lane6,7,16では高分子量の影が見え、さらに、目的とするバンドも太い(オレンジの矢印)。 PCR増幅効率の違いは、サンプルの違いによるものと考える。 DGGEの同一ゲル上で比較する場合はPCR conditionも同じにしておかないと、PCRによる影響が環境の違いを超えてしまう(PCR bias)ので比較することができない。 [対策] PCR conditionをもう少し検討して、非特異配列が得られたサンプル(オレンジの矢印)で鮮明なAGEバンドを得る。 [ちなみに....] -「不明」と書いてあるところを埋めて下さい -Mupidの比較実験はしていません。Meetingでも言いましたが昨日の結果から、電気泳動は支障ないと考えられます。おそらく、マーカーが原因 -昨日の結果を見せて下さい。 -PCR productsのPCR増幅を揃えないとDGGEによる比較はできませんが、時間が無いようでしたら「apply量」と「変性剤濃度幅」の試験は今日のサンプルを使ってできると思います。 -DGGEの電圧と泳動時間を変えることについて。条件は「200V,4h,x0.5 TAE」を基本プロトコルとして行いたいと考えています。詳細は後日伝えますが、もし、DGGE分解能が足りないときにのみ試しましょう。 071009; PCR conditionの検討 [psbAプライマーを使ったDGGE解析の条件検討]-apply量とDN濃度幅の検討- -071002のDGGEから(1)高バックグラウンドと(2)不適切なDN濃度幅(狭い)であったので、&u(){DNAのapply量を減らす(1)}、&u(){DN濃度幅を広げる(2)}ことで改善を図った。 DGGE image #ref(071002-10_DGGE_rsa.jpg) &u(){Condition} -1xTAE,AA=6%,&u(){time=4 h},Syber gold,stain=?? min,destain=?? min -photo; degital camera &u(){Samples} -KH0605,1-9(Stn. ...不明...) -左から、07100x PCRed{No.2,4,6,8,10,12,14,16,18},&u(){47〜100 ng} &u(){Comment;Kataoka} DNA apply量 -100ngに減らすことでより鮮明なバンドパターンが得られた。 -各レーンで揃えることで、サンプル(Stn.)間の違いが見やすくなった。 -レーン6,8,16がスメアであるが、これらのサンプルはAEPでも高分子量領域にスメアな影が見える結果と対応しており、PCRによるartifactであると考えられる。 -apply量を減らすことでノイズと考えられた、071002-DGGEの青矢印で見られた影が消えた。 -一本鎖と思われたバンドが消え、バンドパターンの鮮明さが改善された。僕の経験からもapply量が過剰であればあるほど一本鎖と考えられるバンドの影が邪魔になります。これは、最適DN濃度を持たない一本鎖は分子量により泳動されるのでDN濃度勾配によって分散しないためと考えています。 DN濃度幅 -バンドの位置が全体的に下がり見やすくなった。ただし、ゲル上部にバンドの様な影が見えることからDN 0-80%で一度試しておく良いかもしれない。 -一本鎖と思われたバンド(赤矢印)は泳動条件(time,buffer,AA濃度)が変わらないので、DN濃度が変わったのにも関わらず、ほとんど同じ位置にあります。 -一方、緑矢印で示したバンドは変性剤の濃度幅が変わったことに対応してゲル下方へ移動しています。 [対策] -100ngでもバンドがぼやけており、まだ、DNA量が多いかも知れません。100,75,50,25...ngと段階的に変化させてみることで適切な量が分かるかもしれません。 -AEPで見る限りPCRは良くなってきました。しかし、バンドがぼやけるのはDGGE condition(buffer濃度,AA%)とPCR condition(非得意的増幅,増幅領域)両方の可能性があります。とりあえず一つずつ解決していきましょう。引き続きPCR AEPのバンドが全てのサンプルで一本になるように条件検討を続けて下さい。 [ちなみに] -1xTAEで実験をしていますが、200V,4hでDGGEをするときは0.5xTAEで行うようにして下さい。他の実験と比較するため。 -クランプを締めすぎたからと言って、バンドが不鮮明になることはありません。不鮮明な理由は上記のことが考えられます。 AGE check #ref(071009_psbA_PCR12_0.jpg) &u(){Condition} -1xTAE,Aga=1.5%,&u(){time=40min},&u(){Syber gold;stain= ?? min,destain = ?? min} -photo; degital camera &u(){Samples} -KH0605,1-9(Stn. ...不明...),2µL each -左から、M,071004PCRed{No.2,4,6,8,10,12,14,16,18},M -Marker= 1?? µL each [ちなみに] -Gel 1とGel 2の違いを教えて下さい。ゲルやサンプルを少しくらい放置していてもコンタミが無い限り結果に影響はありません。Gel1とGel2の両方ともとても綺麗な結果だと思います。 -Syber goldでも綺麗な写真が撮れるようになったね。どうやったか教えて下さい。 -Markerが不鮮明なのはMarkerに問題がありそうです。例えば、薄めることが悪いとか。。。

実験ノート

2007-10-02T20:13:29+09:00

片岡メモ

2006-06-28T18:14:37+09:00

メニュー

2006-06-28T07:31:57+09:00

メニュー -[[トップページ]] -[[メニュー]] -[[Procedure]] -[[Protocols]] -[[実験ノート]] -[[片岡メモ]] ---- 更新履歴 #recent( http://www13.atwiki.jp/phyto/pages/4.html,recent,0,1,1,,)

Procedure

2006-05-29T14:35:54+09:00

**DNA extraction ↓　　　↓ ↓ ・Agarose E.P. Check ↓ ・Quantification of DNA ↓ **PCR for 1st DGGE ↓ ↓ → Agarose E.P. Check ↓ **1st DGGE |　　　↓ | 　　Get DGGE pattern → Anaysis of DGGE pattern |　　　↓ | 　　Band Excision |　　　↓ **PCR for 2nd DGGE ↓ ↓ → Agarose E.P. Check ↓ **2nd DGGE ↓ **Purify PCR products ↓ **Cycl-sequencing ↓ **DNA sequencing → DNA sequenc analysis

トップページ

2006-05-28T14:21:37+09:00

実験経過&プロトコル ---- 実権ノートのページに実験の経過を記載しています。 -ウィキはみんなで気軽にホームページ編集できるツールです。 -このページは自由に編集することができます。 -メールで送られてきたパスワードを用いてログインすることで、各種変更（サイト名、トップページ、メンバー管理、サイドページ、デザイン、ページ管理、等）することができます ■　新しいページを作りたい！！ -ページの下や上に「新規作成」というリンクがあるので、それをクリックしてください。 ■　表示しているページを編集したい！ -ページ上の「このページを編集」というリンクや、ページ下の「編集」というリンクを押してください。 **分からないことは？ -[[@wikiの詳しい使い方はヘルプ・FAQ・初心者講座@wikiをごらんください。メールでのお問い合わせも受け付けております。>http://www1.atwiki.jp/faq/]] -[[ユーザ同士のコミュニケーションにはたすけあい掲示板をご利用ください>http://bbs.atwiki.jp/]]

メニュー2

2006-05-21T00:06:09+09:00