http://w.atwiki.jp/phyto/ Phyto@Wiki ja 2007-10-10T14:03:37+09:00 1191992617 https://w.atwiki.jp/phyto/pages/9.html 他のページへ [[実験ノートへ戻る>実験ノート]] [[Protocols>Protocols]] [[Procedure>Procedure]] [[トップページ>トップページ]] [[メニュー>メニュー]] ---- メモ AgaroseGel hight = 120 mm @ 36 ppi DGGE Gel hight = 280 mm @ 36 ppi ---- 071002; psbAプライマーを使ったDGGE解析の条件検討 &u(){Reference} -不明 &u(){Protocole} -不明 &u(){Condition} -不明 &u(){Samples} -KH0605,1-9(Stn. .......) DGGE image #ref(071002_DGGE_rsa.jpg) &u(){Comment;Kataoka} [バンドA;赤色] -Aで示した3本のバンド(赤色)は目的の2本鎖DNAではない可能性がある。1本差DNAと考えられる。これは、長時間の電気泳動したときにこのバンドの停止位置が変性剤濃度によらないことから確認済。 [バンドB;青色(一部)] -ウェルのかたちを反映したバンドの形状からしてこちらも、目的のDNAかどうかは不明。 [バンドC;緑色(一部)] -このバンドが目的のバンド。 Cyanobacteriaのプライマーセット(CYA351-CYA781)で得られたパターンと類似している。得られる塩基配列に期待が持てる。 ただし、(1)バンド位置がゲルの上部に偏っていること、(2)バンドが太いことに関して検討が必要。 [対策] (1) 一番最初の条件検討としては変性剤濃度勾配の幅が狭い。0-50%の濃度幅で試すことが必要。 (2) (1)を行うことで解決する可能性がある。 全体的にバンドがシャープではなく、バックグラウンドが高い。 -下記のPCR産物のAGP(Agarose Gel Electrophoresis)のバンドの濃さから考えて過剰にapplyされているためにDGGEに最適な解像度が得られていないと考えられる。AGEの濃さと16µLと言うことから考えて(600ng以上かも知れない...)、DGGEの解像度を得るには過剰である。app 2007-10-10T14:03:37+09:00 1191992617 https://w.atwiki.jp/phyto/pages/8.html 2006-06-28T18:14:37+09:00 1151486077 https://w.atwiki.jp/phyto/pages/7.html **DNA extraction ↓　　　↓ ↓ ・Agarose E.P. Check ↓ ・Quantification of DNA ↓ **PCR for 1st DGGE ↓ ↓ → Agarose E.P. Check ↓ **1st DGGE |　 　　↓ | 　　Get DGGE pattern → Anaysis of DGGE pattern |　 　　↓ | 　　Band Excision |　 　　↓ **PCR for 2nd DGGE ↓ ↓ → Agarose E.P. Check ↓ **2nd DGGE ↓ **Purify PCR products ↓ **Cycl-sequencing ↓ **DNA sequencing → DNA sequenc analysis 2006-05-29T14:35:54+09:00 1148880954 https://w.atwiki.jp/phyto/pages/6.html 使用後の実験器具は直ちに片付けること ---- DNA抽出法 Phenole/Chloroforme法 -18 Samples (x19) 海水を1-2L濾過したフィルターを1.5mLチューブに移す ↓ [物理破壊] TE 260mLをそれぞれ加え、ペッスルでフィルターをすりつぶす。(フィルターは砕けない・・・。) ↓ [タンパク分解;ProteaseK] TE 200µL,SDS 30µL, ProteaseK 3µLを加え、37℃で1hインキュベート premix (TE 3.8mL+SDS 0.57mL)から230µL ↓ [細胞壁破壊;凍結融解] 凍結(-80℃)と融解(37℃)を3回繰り返す ----------------------> -80℃で保存可能 ↓ [タンパク凝縮;CTAB] 5M NaCl 100µL, CTAB 80µLを加え65℃で10minインキュベート premix (NaCl 1.9mL+CTAB 1.52mL)から180µL ↓ [タンパク質除去;フェノール/クロロホルム抽出] PCIx2,CIA(780µL) ↓ [DNA精製;イソプロパノール/エタノール沈殿] IP,EtOH(780µL) 70%EtOH沈殿(780µL) TE 57µLに溶かす ↓ [抽出の確認;Agarose gel EP] 5µLを1.5% agarose gelで確認 ↓ [濃度計測] 2µLを吸光光度計で濃度計測 ↓ [濃度を揃える] 適当な濃度になるようにTEを加える 5本に分注して-80℃で保存(ラベルは白) Quantification of nucleic acids - using UV absorbance at 260 nm, with an absorbance of 1 corresponding to 100 mg of DNA par litter according to equipmet's manual - equipmet : Genequant TM (Amersham Pharmacia) with ultramicrocell (5 µl) - 簡単、且つ小ボリュームでDNAを計測できる利点がある [サンプルの準備] 2007-10-15T11:39:14+09:00 1192415954 https://w.atwiki.jp/phyto/pages/4.html 2007-10-02T20:13:29+09:00 1191323609 https://w.atwiki.jp/phyto/pages/3.html 2006-05-21T00:06:09+09:00 1148137569 https://w.atwiki.jp/phyto/pages/2.html メニュー -[[トップページ]] -[[メニュー]] -[[Procedure]] -[[Protocols]] -[[実験ノート]] -[[片岡メモ]] ---- 更新履歴 #recent( http://www13.atwiki.jp/phyto/pages/4.html,recent,0,1,1,,) 2006-06-28T07:31:57+09:00 1151447517 https://w.atwiki.jp/phyto/pages/1.html 実験経過&プロトコル ---- 実権ノートのページに実験の経過を記載しています。 -ウィキはみんなで気軽にホームページ編集できるツールです。 -このページは自由に編集することができます。 -メールで送られてきたパスワードを用いてログインすることで、各種変更（サイト名、トップページ、メンバー管理、サイドページ、デザイン、ページ管理、等）することができます ■　新しいページを作りたい！！ -ページの下や上に「新規作成」というリンクがあるので、それをクリックしてください。 ■　表示しているページを編集したい！ -ページ上の「このページを編集」というリンクや、ページ下の「編集」というリンクを押してください。 **分からないことは？ -[[@wikiの詳しい使い方はヘルプ・FAQ・初心者講座@wikiをごらんください。メールでのお問い合わせも受け付けております。>http://www1.atwiki.jp/faq/]] -[[ユーザ同士のコミュニケーションにはたすけあい掲示板をご利用ください>http://bbs.atwiki.jp/]] 2006-05-28T14:21:37+09:00 1148793697