元パラシュート部隊の退役軍人サミュエル・ウィルソンが朝のランニング中にスティーブ・ロジャース（
キャプテン・アメリカ）と出会う。
少し会話した後、スティーブはナターシャ・ロマノフ（
ブラックウィドウ）と共に元フランスの工作員で海賊の
バトロック
の一味にジャックされたS.H.I.E.L.D.の船舶奪還と人質救出の任務に向かった。
格闘戦の末にバトロックを倒すが隙を突いて逃げられてしまう。一方、スティーブはナターシャが別の任務を帯び、船の端末からS.H.I.E.L.D.の情報をコピーしているのを目撃する。
S.H.I.E.L.D.の本拠地トリスケリオンでニック・フューリー長官と面会したスティーブは「インサイト計画」の存在を知らされる。それは新型ヘリキャリア３機と衛星をリンクし、軌道上から市民を監視し、テロなどの脅威の排除を実行する防衛システムだった。スティーブはやりすぎだと反発するが、フューリーは受け入れない。
スティーブが去った後、フューリーはナターシャから受け取ったデータにアクセスしようとするが、自らの名で情報規制がかかっているにもかかわらず、インサイト計画の機密から締め出されていることに気づくのだった。
トリスケリオンを車で後にしたフューリーは警官に変装した武装集団に襲撃される。カーチェイスの末に振り切るが、最後に現れた漆黒のプロテクターと覆面に身を包んだ男に車を破壊されてしまう。フューリーは地面に穴を開けることで辛くも難を逃れるのだった。
アパートに帰ったスティーブを負傷したフューリーが待ち受けるが、フューリーは窓から狙撃され瀕死の重傷を受け「誰も信用するな」と告げスティーブにメモリースティックを手渡す。これはナターシャが船から吸い出したデータだった。同じアパートの住人に扮していた女性がエージェント１３を名乗り、フューリーを介抱している間にスティーブは狙撃手を追う。
そこにはフューリーを襲撃した覆面の男がいて、スティーブが投げた盾を片手で受け止めて投げ返すと夜の闇に姿を消してしまう。
フューリーは蘇生手術を受けるが深夜に死亡が確認された。
S.H.I.E.L.D.の本拠地に呼び戻されたスティーブは理事のアレキサンダー・ピアースからバトロックを逮捕したこと、フューリーこそ船舶ジャックの黒幕で目的は機密情報を盗むことだったと告げられる。
帰りのエレベーターでS.T.R.I.K.E.チームから襲撃を受けたスティーブは反撃して逃れ、ナターシャと会う。
ナターシャを問い詰めるとフューリーを襲ったのは過去５0年で20件以上の暗殺に関わった「ウィンター・ソルジャー」だと聞かされる。メモリースティックを解析し、インサイト計画の謎を追う2人が辿り着いたのはニュージャージー州リーハイの軍施設跡で、ここはスティーブが超人兵士計画の候補生として訓練を受けた始まりの地だった。
施設の地下にはS.H.I.E.L.D.秘密基地の隠し部屋があり、そこには死んだはずの
アーニム・ゾラが自らの頭脳を6万mものデータテープに写し、電子頭脳となって存在し続けていることを知る。
そしてゾラは第二次世界大戦にS.H.I.E.L.D.に呼ばれて科学者として従事し、一方で内部で秘密結社ヒドラを寄生虫のように育て巨大化させて来たことを語るのだった。そしてインサイト計画こそヒドラとゾラが人類の自由を奪うための計画だったことを語ったところで、ミサイルがスティーブを抹殺するため基地を襲う。
難を逃れた2人はサミュエル・ウィルソンを頼り、そこで彼が且つて極めて困難な救出ミッションを成功させたことを知り、協力を求めるのだった。
サミュエルはその作戦で使用した飛行型強化スーツ"EXO-7 ファルコン”を手に入れ、２人に協力する。
S.H.E.LD.幹部のシットウェルからインサイト計画とは過去のあらゆる情報から抵抗が予想される人々を予測し、数百万人を同時に攻撃、抹殺するための計画だと知らされる。
ヘリキャリア発進まで１６時間と迫る中、中止のため奔走する一行をウィンター・ソルジャーが襲う。
激戦の中でウィンター・ソルジャーの覆面が外れ、現れたのはスティーブの７０年前の親友、バッキー・バーンズと瓜二つの顔だった。
唖然とする中でS.T.R.I.K.E.チームに拘束された３人だったが、護送車両の中で隊員に紛れ込んでいたマリア・ヒルに救出される。
ヒルに案内されて向かった廃墟では、死を偽装したフューリーが待っているのだった。
インサイト計画の全貌と停止させる手段を知り、３機の新型ヘリキャリアを止めるため強襲をかけるスティーブとサミュエル。
一方、ナターシャフューリーはトリスケリオンに潜入し黒幕のピアースと対峙する。
激戦の果てに計画を破壊することに成功。墜落するヘリキャリアの中で尚もスティーブはウィンター・ソルジャーと対峙する。
動けなくなったウィンター・ソルジャーをスティーブが助けるが、スティーブは落下し海中へ没する。
ウィンター・ソルジャーもまたスティーブを救出し、何処かへ姿を消すのだった。
こうしてS.H.I.E.L.D.は崩壊し、内部に救っていたヒドラは残党たちが地下に潜り活動を続けるのだった。
