2生化学まとめ_new 2010

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（５）吸光度とは何か。
（８）RNAおよびタンパク質の吸光は何nmか。それは何に由来するか。

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（１）細胞に含まれる高分子化合物を4種挙げよ。
多糖、脂質、タンパク質、核酸

（２）DNAは、血液中のどの細胞種により分離されるか。
白血球

（３）本実習では、DNAを分離するのに、DNAのどのような性質を用いているか。
DNAを分離するのにsilica-membraneを用いている。DNAは高濃度の塩の存在下で、疎水結合によってsilica-membraneに吸着する。そしてこのsilica-gelへの吸着はpH依存性で、pH≦7.5で95%吸着しているが、pH が高くなると急激に吸着率が下がる。この性質を用いてDNAを分離する。

（４）DNA以外の高分子は、操作の過程でどのように除去されたか。
DNA以外の高分子は、DNAをシリカゲルに結合させることで除去される。proteinase KはDNA結合タンパク質の除去、エタノールはRNAの分離、Buffer AEはDNAを溶出して分離する。

（５）吸光度とは何か。

###吸光度はSample Cellの光路長とSample濃度 (C) に比例し、A = αLCで表され、これをランベルト・ベールの法則と呼ぶ。このランベルト・ベールの法則を使い、検量線から物質濃度を測定することが可能である。###

　C:モル濃度　d:光路長　ε物質の固有値

ある希薄溶液中に光を入射するとき、I0 = 入射光強度、I = 透過光強度とすると、
上のような関係が成り立つ。濃度が濃いほど光は吸収される。
dは光路長である。物質を通り抜ける距離を表す。εはモル吸光係数といい、物質について固有の値を示す。
DNAは高分子であるため、モル濃度では表すことは出来ない。そのため、濃度は質量(μg/ml)での表現となり、A260 = 1をひとつの定数としている。

（６）DNAの吸光は何に由来するか。
DNAの吸光はATGCの塩基に由来する。これはDNAの塩基が環状二重結合を持つプリン/ピリミジン骨格を有するためである。

（７）2本鎖状態のDNAと1本鎖状態のDNAの吸光度の違いについて。

二本鎖DNAと一本鎖DNAでは、二本鎖のほうが吸光度は小さい。
二本鎖DNAは、個々の塩基が水素結合などにより規則正しい二重らせん構造を形成しているが、一本鎖DNAでは
DNAの吸光度の由来であるプリン環やピリミジン環が自由に露出しているためにそれぞれが独自に光を吸収するために
一本鎖DNAのほうが、吸光度が大きい。
二本鎖の１A=５０μg/ml、一本鎖の１A=３３μg/ml

（８）RNAおよびタンパク質の吸光は何nmか。それは何に由来するか。
　RNAもDNAと同じく、吸光は塩基に由来する。このため吸光極大はおよそ260nmである。タンパク質の吸光はチロシン・トリプトファン・フェニルアラニンという、芳香族の環状構造に由来する。そのため吸光極大はおよそ280 nmである。
（９）DNAの回収量を算出せよ。
ＤＮＡ回収量＝濃度×２００μｌ

濃度＝（一回目の吸光度のＡ３２０の値－Ａ２６０の値）×５０×希釈率（１）

（１０）DNAの純度はどうか。その根拠は。
DNA の純度はグラフの形より判断ができる。たとえば、蛋白質の混入が多いとき280nm付近で極大値をとるし、不純物の混入はA320の数値が上昇する。
数値に関しては、260nmと280nmの吸光度測定と以下の式を用いて算出することができる。
DNA純度=260nm吸光度/280nm吸光度
高純度のサンプルではDNA純度の値は約1.8~2.0になるといわれている。
また、RNAに関しては、吸光極大が260nmでありDNAと同じであるため、吸光度からでは判別することはできない。RNAの混入を調べるには電気泳動行うなどする必要がある。

（１１）DNA の合成に最低限必要なものを挙げよ。
デオキシヌクレオチド３リン酸、鋳型ＤＮＡ,ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー鎖

（１２）PCR法の原理を説明せよ。
ＰＣＲ法とは、ＤＮＡクローニングのために、細菌のＤＮＡ複製システムを借用した手法である。ＰＣＲ法は３つのステップから成っており、これらは温度を変えていくだけでシフトさせられるため、非常に簡単である。まずは試料に、細菌の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、大過剰のプライマー鎖、アデニン・グアニン・シトシン・チミンのデオキシヌクレオチド３リン酸を加える。ステップ１は、９４℃１分で、２本鎖ＤＮＡを解離させる。ステップ２は、５３℃３０秒で、プライマーＤＮＡを解離したＤＮＡにアニーリングさせる。ステップ３は、７２℃３０秒で、ポリメラーゼにＤＮＡを伸長させる。これを繰り返して、ＤＮＡを増幅させる。

（１３）Taqポリメラーゼはどのような性質を持つか。
Taq polymeraseは好熱細菌Thermus aquaticusのポリメラーゼである。エクソヌクレアーゼ活性（校正機能）を持たないのでエラーが生じやすい。

（１４）PCR 法を用いてRNAを検出する方法はどのようなものがあるか。
PCR法を用いてRNAを検出する方法には、逆転写 PCR（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction, RT-PCR）という方法がある。
PCR はDNAを増幅する反応だが、RT-PCRはRNAからDNAを合成し、そのDNAを増幅する方法である。
RNAは3'末端にAAA・・（ポリ A）配列があるので、相補的なTTT・・・（オリゴdTプライマー）を合成して、逆転写酵素を用いてRNAを鋳型にし、一本鎖のcDNA （cは“相補的”を意味する“complementary”の頭文字。）を合成する。その後、生成された cDNAに対してPCRを行う。
RT- PCRの利用について。真核生物の遺伝子にはイントロンが含まれる。しかし、mRNAにはイントロンが含まれないので、タンパク質をコードする遺伝子を得たいときにはmRNAから合成するRT-PCRの方が有利である。また、レトロウイルスなどの一部のウイルスは、RNA しかもっていない。そのため、このようなウイルスの感染を証明する場合にRT-PCR法を用いることがある。

（１５）PCR法は、医学的にどのように利用されているか。
遺伝子産物の大量生産、遺伝子疾患の診断、感染症の検出、個人識別など

（１６）ゲル電気泳動の原理を説明せよ。
アガロースゲル電気泳動などのゲル電気泳動は、DNAやRNAなどの核酸とそれらの電気的な性質を利用して分離する方法である。長いDNA断片はアガロースゲルの網目構造内をゆっくりと（引っかかりながら）動くのに対して、短いDNA断片はより速く（あまり引っかからずに）動くことから、アガロースゲル電気泳動法では、DNA断片を長さによって分離することが可能になる。

（１７）DNAはどちらの電極に向かって移動したか。その理由は。
核酸は「－」の電荷を帯びているため、電場に置かれると＋極側に移動すると考えられる。

（１８）エチジウムブロマイドの役割を説明せよ。
DNAの2本鎖に挿入されるインターカレーターで、核酸に結合する。核酸に結合した状態でUVを当てると強い蛍光を発するので、特に分子生物学実験における核酸の検出用に使われる。（インターカレートとは、分子もしくは分子集団がほかの分子もしくは分子集団の間に入り込むこと。今回はDNAの塩基対の間にエチジウムブロマイドが入り込んだ。
　RNAは一本鎖だが、分子内で高次構造をとり塩基対を形成するため、RNAでも検出される。）今回も核酸の検出用に使われた。おそらく、それまでの実験過程で核酸が失われていないことを確認するためであったのだろう。

（１９）PCRは成功したか。その根拠は。
1 本の濃いバンドが見え、それはマーカーから判断してALDH2のexonのbpとほぼ一致している。PCRは成功したと考えられる。

（２０）PCRによるALDH2遺伝子断片の増幅率の理論値はどれくらいか。
PCR法は、①鋳型DNAの熱変性②プライマーのアニーリング③DNA合成、の3stepからなり、このサイクルを数十回繰り返す。理論的には①サイクルごとにDNA量は２倍になる。実験では４０サイクルとしているので、理論値は2⁴⁰になる。

　　理論値：PCRサイクルを40回行うので、2⁴⁰≒1.1×10¹²（倍）
　　実際は、PCR後に100µl中にX(ng)のDNAがあるとすると、10μl中に含まれるDNA
　　9X/10（ng）を50µlの水に溶出するので、9X/10 ÷ 50（ng/µl）となる。
実測値が3.8ng/µlなので、X＝211(ng)
そして、129塩基がY倍に増えたとすると、129×200×Y÷(3.0×10⁹)＝211
　　よって、Y≒2.45×10⁷（倍）

（２１）塩基配列決定法として、ジデオキシ法を使用した。この原理を説明せよ。
DNA合成酵素を用いてDNAを合成することによりDNAの塩基配列を決定する。1本差の目的DNAを鋳型として、これに相補的なオリゴヌクレオチドをアニールさせ、これを合成のプライマーとし、ＤＮＡポリメラーゼに鋳型ＤＮＡと相補的なＤＮＡを合成させる反応を行わせる。このときのＤＮＡの材料としてA/T/G/Cそれぞれのデオキシヌクレオチド(dNTP)とその類似のアナログであるA/T/G/Cいずれかのジデオキシヌクレオチド(ddNTP)を加える。ジデオキシヌクレオチドは3'-OHが3'-Hになっているため、これが合成中のＤＮＡに取り込まれると5'-3'ホスホジエステル結合は作れないためDNAの合成はそこで止まってしまう。もしddNTPを加えたとすると、このときddNTPは合成されるDNA上の各Aに取り込まれる。合成されるDNA上の各Aで反応の止まったそれぞれの長さのDNAが合成される。これを4つの塩基で別々に行い、ポリアクリルアミドゲルで電気泳動を行った後、大きさベルに分離することで、DNAのどの位置にどの塩基が存在するのかわかるようになる。
反応系には化学蛍光物質や放射性同位体で標識したプライマーやdNTPを加えるので、合成されるDNAは標識され、電気泳動により分離されたDNAを認識することが出来る。
この方法で用いられるDNAポリメラーゼはエキソヌクレアーゼ活性が遺伝子工学的に除いてある。
（22）このシーケンス反応と実習第2日目のPCR反応との違いは何か？
PCR（Polymerase Chain Reaction）反応は、特定のDNA配列を増幅する反応である。一方、シーケンス反応は、DNAの塩基配列を決定する反応である。この際、PCR反応とは異なり、プライマーを１つしか用いないため、片側からしか合成が行われず、DNAは増幅しない。その代わりに、4色の蛍光色素が別々に結合したddNTPがdNTPと共に一定の割合含まれているため、1塩基差の様々な長さの1本鎖DNA断片が合成される。

（２３）srquencing pre-mixには何が含まれていると考えられるか。
DNAポリメラーゼ、dNTP、ddNTP、プライマー
（２４）キャピラリー電気泳動の原理について

内径５０～１００μｍ、長さ２０～７０㎝の毛細管中で電気泳動する。現在ではポリマーを含む緩衝液が主流。電気泳動緩衝液にポリマーを加えることで泳動中にゲル濾過効果が生じ分子量や分子の形の差により生体高分子を分離する。

（25）操作１２は何のために行うか。

電気泳動の準備として2本鎖DNAを1本鎖DNAにする必要がある。
95℃で２分間加熱すると２本鎖DNAは１本鎖DNAとなる。
このまま徐々に冷却するとまた２本鎖DNAに戻ってしまうが
急冷することにより1本鎖DNAの状態を保つことができる。

（26）SNPについて説明せよ。

ある生物種集団のゲノム塩基配列中に一塩基が変異した多様性が見られ、その変
異が集団内で1%以上の頻度で見られる時、これを一塩基多型（SNP : Single
Nucleotide Polymorphism）と呼ぶ。従って、対立遺伝子頻度がこれより低いと
きに使用するのは基本的に誤りで、そのような物は突然変異と呼ばれる。

SNP生成の原因としてもっとも頻度が高いのはシトシンからチミンへの変異であ
る。これはDNAがA, T, C, Gという塩基の違いのみで生命の情報を伝達している
だけではなく、塩基のメチル化というもうひとつのメカニズムを使って情報を保
持しているからである。

SNP、つまり個人間の1塩基多型は人で約1キロベースに一つと言われている。こ
れはヒトゲノムが30億塩基対であることを考えると約300万個のSNP があるとい
うことを表す。SNPの意義としては、
①SNPは他のＤＮＡマーカーと比べるとよりゲノム全体をカバーしているため、あ
る疾患のグループと正常人のグループのSNPのパターンや頻度を比較すればどの
SNPがどの病気と関連しているかという情報が得られる。
②薬物の個人間の効き目の違いは、SNPにより個人間で身体に発現しているタンパ
ク質の量や質が微妙に異なることが原因だという可能性が考えられる。
　a.タンパク質の発現量に影響する場合：SNPが蛋白質の発現をコントロールす
る場所にあった場合、ヒトによってある蛋白質の発現量が違うことになる。
　b.タンパク質の質に影響する場合：SNPが蛋白質をコードする部分にあった時
にはアミノ酸配列に変化を与える場合とアミノ酸に変化を与えない場合がある。
もしアミノ酸配列を変化させる場合は蛋白質の構造や活性等に影響を与え、酵素
であれば酵素活性が変わる可能性がある。

（27）遺伝子変異には、他にどのようなタイプが存在するか。また、それはどのような手法により検出が可能か。

遺伝的多型の種類
VNTR（variable number of tandem repeat）
VNTRは数塩基～数十塩基からなる配列が繰り返し存在するもので、ゲノム中に数百～数千箇所ある。この繰り返しの数が個体によって異なる
STRP（short tandem repeat polymorphism）
STR（マイクロサテライトともいう）は2～7塩基からなる配列が2～数十回反復するもので、この回数に多型が見られ、STRPと呼ぶ。VNTRに比べて多く存在し、突然変異により変化する率が高い。
繰り返し回数の多いものは突然変異を蓄積しやすく、そのような繰り返し回数の異常が疾患（脆弱X症候群、ハンチントン病など）の原因となるものも存在する。
(27)具体例と検出法
具体例として、結核菌の検出に使われている方法を挙げる。
生きた結核菌から１μg以上のゲノムDNAを採取し、切断酵素PvuⅡで切断する。そして、電気泳動してナイロン膜に転写する。これをゲノム上にランダムに挿入された配列のIS6110をプローブとして用いてハイブリダイゼーションを行う。
すると、反応したバンドの本数はゲノム上に存在したIS6110の数に反映し、バンドの分子量は制限酵素で切断された部位とIS6110との距離を示す。このように、IS6110の数と位置という２つの因子で菌株を鑑別する。
なお、制限酵素により切断して生じる断片の長さの違いに基づく多型をRFLP（制限酵素断片長多型）という。

(28)日本人における不活性型ALDH遺伝子の遺伝子頻度を25％とすると、(+/+)、(+/－)、(－/－)の各遺伝子型を持つ人の比率はそれぞれどのような値になるか。

不活性型ALDH遺伝子の遺伝子頻度が25％なので活性型ALDHの遺伝子頻度は75％といえる。よって、各遺伝子型の比率は
(+/+)→3/4×3/4=9/16
(+/－)→(3/4×1/4)×2=6/16
(―/―)→1/4×1/4=1/16
より、(+/+)：(+/－)：(―/―)＝9：6：1　(=56.25％：37.5％：6.25％)となる。

（29）

　活性型ALDH遺伝子の遺伝子頻度をαとすると、

　（+/+）=

、（+/-）=2α（１-α）、（-/-）=　

　また、これまでのデータから、（+/+）；369人、（+/-）；267人、（-/-）；31人、総数；667人なので、

・・・①、2α（１-α）=

・・・②、

・・・③となる。
① から　α=0.7438

② から　α=0.7233

③ から　α=0.7844

3つの平均をとって、α=0.7505

よって、活性型ALDH遺伝子の遺伝子頻度は75.05％

（３０）①個人情報の保護、②インフォームドコンセントについて何故このような措置が必要なのか？
① 概念的なレベルにおいて、個人の不利益になる可能性の有する情報には慎重な対応が求められていると考えられるが、概念的なレベルの話は②でするとして、① に関して、「一般的通念上当然である」や法的解釈で用いられる「社会通念上相当」などで回答を求められる質問ではないと判断できるので、ここでは、法的根拠をする。

個人情報の保護においては平成15年に次のような法律が定められている、

個人情報の保護に関する法律（平成一五年五月三十日法律第五十七号）
2003年（平成15年）5月23日成立、2005年（平成17年）4月1日全面施行

この法律は第二章、第三章と行政機関においての個人情報の取り扱いを説いているので、
ここでは第一章総則、第四章、個人情報取扱事業者の義務等
に注目する。

基本理念として
個人情報は、個人の人格尊重の理念の下に慎重に取り扱われるべきことに鑑み、その適正な取扱いが図られなければならない（第3条）。
とあり、
個人情報の定義は、
個人情報とは、生存する個人の情報であって、特定の個人を識別できる情報（氏名、生年月日等）を指す。
これには、他の情報と容易に照合することができることによって
特定の個人を識別することができる情報（学生名簿等と照合することで個人を特定できるような学籍番号等）も含まれる（2条1項）。

よってDNAは氏名など、後天的につけられた、関係性上の定義づけされた産物であるどころか、
個人そのものを先天的に決定付けられたものであるので、個人情報の中でも特に取り扱いに注しなくてはならないものに分類される。

個人情報について
利用目的の特定（15条）
利用目的の制限（16条）
適正な取得（17 条）
取得に際しての利用目的の通知（18条）
個人データについては、データ内容の正確性の確保（19条）、
安全管理措置や従業者・委託先の監督（20条 - 22条）、第三者提供の制限（23条）が定められている。

保有個人データについては、事項の公表等（24 条）、開示（25条）、訂正等（26条）、利用停止等（27条）が規定されている。

事項の公表、開示、訂正、利用停止の規定により、本人から求められた措置の全部又は一部について、その措置をとらない旨を通知する場合又はその措置と異なる措置をとる旨を通知する場合は、本人に対し、その理由を説明するよう努めなければならない（28条）。

と第四章にあり、DNA検査においては利用目的を治療、もしくは、意義のある実験などに限定される必要性がある。

また第三者提供の制限においては
個人情報取扱事業者は、以下の場合を除いては、あらかじめ本人の同意を得なければ、個人データを第三者に提供してはならない（23条）。

法令に基づく場合（統計調査等）
人の生命、身体又は財産の保護のために必要がある場合であって、本人の同意を得ることが困難であるとき（事故の際の安否情報など）
公衆衛生の向上または児童の健全な育成の推進のために特に必要がある場合であって、本人の同意を得ることが困難であるとき（児童虐待情報など）
国の機関若しくは地方公共団体又はその委託を受けた者が法令の定める事務を遂行することに対して協力する必要があって、本人の同意を得ることにより当該事務の遂行に支障を及ぼすおそれがあるとき（犯罪捜査の協力等）
但し、必ずしも本人の同意を得なくとも、以下の場合は第三者への提供ができるものと規定されている。

第三者に提供される個人データについて、本人の求めに応じて当該本人が識別される個人データの第三者への提供を停止することとしている場合であって、①第三者への提供を利用目的とすること、②第三者に提供される個人データの項目、③第三者への提供の手段又は方法、④本人の求めに応じて当該本人が識別される個人データの第三者への提供を停止すること、についてあらかじめ、本人に通知し、又は本人が容易に知り得る状態に置いているときは、前項の規定にかかわらず、当該個人データを第三者に提供することができる。（第23条第2項）

また、個人情報取扱事業者と実質的に同一と見なし得る事業者が共同で利用する場合、共同利用または業務委託として一定の要件を満たした場合、第三者と看做されない規定がある。すなわち、これらの場合、本人の同意を得る必要がない。

とあり、第三者への提供については被験者の同意が得られない場合はよほどの例外でない場合はされるべきではない。

② インフォームドコンセントについて、
広辞苑から抜粋すると、
「医学的処置や治療に先立って、それを承諾し選択するのに必要な情報を医師から受ける権利。
医療における人権尊重上重要な概念として各国に普及」
とあり、
医学的処置、治療の物理的、化学的、社会的な影響について、知らされるべき情報を得られる権利と解釈してよい。
ここでは知らされるべき情報は被験者の不都合な情報と考えられるので、
つまり遺伝子治療、遺伝子検査における、不利益を列挙すればよいと考えられる。

社会的差別（保険加入の拒否、就職の不採用、婚姻の破棄）などを受ける可能性の存在である。

例えば、ガンになる可能性が高い遺伝子情報が、がん保険会社等に
漏れるとガン保険はもちろんのこと普通の保険にも入ることが困難になってしまう可能性がある。
また、早逝する可能性が高いことが分かっている人間を、技術系の企業で比較的良く見られる、
人間を育て、技術を習得させ、終身雇用をモットーとしている企業が取るとは思えない。
また、早逝する、比較的若い年齢で癌などの重病を発症する人間を生涯の伴侶に選ぶ人間も、次世代のことを考えれば少ないだろう。

故に、将来発生する可能性を客観的に証明できてしまう、また社会的に信頼のおける情報として取り扱われているDNA検査において得られる情報は、それにかかわった全ての医療従事者や医師・看護師がその取り扱いを厳重にしなければならない。