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  071002; psbAプライマーを使ったDGGE解析の条件検討
&u(){Reference}
-不明
&u(){Protocole}
-不明
&u(){Condition}
-不明
&u(){Samples}
-KH0605,1-9(Stn. .......)

DGGE image
#ref(071002_DGGE_rsa.jpg)
&u(){Comment;Kataoka}
[バンドA;赤色]
-Aで示した3本のバンド(赤色)は目的の2本鎖DNAではない可能性がある。1本差DNAと考えられる。これは、長時間の電気泳動したときにこのバンドの停止位置が変性剤濃度によらないことから確認済。
[バンドB;青色(一部)]
-ウェルのかたちを反映したバンドの形状からしてこちらも、目的のDNAかどうかは不明。
[バンドC;緑色(一部)]
-このバンドが目的のバンド。
Cyanobacteriaのプライマーセット(CYA351-CYA781)で得られたパターンと類似している。得られる塩基配列に期待が持てる。
ただし、(1)バンド位置がゲルの上部に偏っていること、(2)バンドが太いことに関して検討が必要。
[対策]
(1) 一番最初の条件検討としては変性剤濃度勾配の幅が狭い。0-50%の濃度幅で試すことが必要。
(2) (1)を行うことで解決する可能性がある。

全体的にバンドがシャープではなく、バックグラウンドが高い。
-下記のPCR産物のAGP(Agarose Gel Electrophoresis)のバンドの濃さから考えて過剰にapplyされているためにDGGEに最適な解像度が得られていないと考えられる。AGEの濃さと16µLと言うことから考えて(600ng以上かも知れない...)、DGGEの解像度を得るには過剰である。apply量が多い場合にDGGEの解像度が悪くなる例は下記の参考実験を参照。
-AGEの画像解析からPCR産物のDNA濃度(ng/µL)を推定し、段階的に希釈したPCR産物でDGGEを行うことで最適なapply量を決定できる。
-非特異的に増幅されたPCR産物(特に750bp以上の断片)がDGGEのゲル上部のスメアの原因

PCR image
#ref(20071002_PCR.jpg)
&u(){Condition}
-1xTAE,Aga=1.5%,time=40min,Et-Br,stain=30min,destain=10min
-photo; degital camera(filter=UV&red,mode=AE, Tv=1, Av=8.0, 測光方式=評価測光, ISO=400, 焦点距離=5.4mm)
&u(){Samples}
-KH0605,1-9(Stn. .......),2µL each
-Marker=1µL each
&u(){Comment;Kataoka}
増幅されたバンドについて
-750bpの位置にバンドがあるので目的のpsbA遺伝子領域を増幅できていると考える。
-750bp以上の増幅が大きいことから、PCRによるartifactの増幅が多い。
バンドの濃さについて
-マーカーと比較して750bpのバンドが太く濃いことから、PCRによる増幅は飽和していると考えられる。また、ゲル最下部のプライマによる陰が僕の経験と比べても濃いように思う。
以上のことから、genomeにprimerが着く反応に加えて、genomeもしくは増幅されたPCR産物のprimerサイト同士が着くことでartifactを形成しているかも知れない。
[対策]
750bp以上のサイズの非特異増幅産物が見られること。750bpバンドが濃い(太い)ことから考えてPCRによる増幅は過剰であると考えられる。
-非得意的な増幅を避けるために、PCRサイクル数を減少させることで750bp以上のサイズのバンドが減少することが期待できる。
(Ishii and Fukui 2001; Applied and Environmental microbiology 2001 p3753-3755)
過剰のprimerが残存しているがDGGEへの影響は不明。もしかしたら過剰のprimerはPCR反応中にartifactの原因となるかもしれない。(ただし、推測の域を出ない)
-primerの量を減らすことでartifactの可能性を減らすことができる。
-anniling温度を下げることでprimerのannilingが相対的に増加し、目的の遺伝子部位を増幅する効率が上がるかもしれない。

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参考データ(operated by Tak)
#ref(20060909_1_LR.jpg)
変性剤能動勾配によってバンド位置の決まらない1本鎖DNAと思われるバンドのDGGE中での動き。
-1〜8時間、時間差でDGGEをすると赤矢印以外のバンドは最適な変性剤濃度勾配の位置で停止するが、このバンドは止まらない。
(primer=EUB341F-GC-907R,25-45%DN,6%AA)

#ref(20070314_1189_apply_5.jpg)
DGGEにapplyするDNAの質量(ng)によるバンドの見え方の違い。
-400ngのレーンAは濃く太いバンドが見られる。現れた他のバンドも太くバックグラウンドも高い。
-150-75ngに最適値がある。50ng以下ではバンドとして検出されないものの方が大きくなる。 
レーンB〜Dは同一サンプル、レーンAのみ異なるサンプル。
(primer=EUB341F-GC-907R,6%AA)

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