エチレモン（p3～p15)
【注意事項】
・化学・生物学実験における一般的な注意事項、ならびにテキストの各々の箇所に記 載された注意事項を守ること。
・「遺伝子組換え生物な等の使用等の規制による生物の多様性の確保に関する法律 （2004年2月19日施行）」および関連規制・省令を守ること。特に、以下の点に留 意すること。
→遺伝子組換え生物等を含む廃棄物（廃液を含む。以下に同じ。）については、廃 棄の前に遺伝子組換え生物等を不活化するための措置を講ずること（第二種省令 第4条第1号別表第２ﾛ（1））
→実験台については、実験を行った日における実験の終了後、及び遺伝子組換え生物 などが付着したときは直ちに、遺伝子組換え生物等を不活化するための措置を講ず ること（同ﾛ（３））
→実験室の扉については、閉じておくこと（実験室に出入りするときを除く。）（同ﾛ （４））
→遺伝子組換え生物等を取り扱うものに当該遺伝子組換え生物などが付着し、又は感 染することを防ぐ為、遺伝子組換え生物などの取り扱い後における手洗いなど必要 な措置を講ずること。（同ﾛ（８））
→実験の内容を知らないものが、みだりに実験室に立ち入らないための措置を講ずる こと（同ﾛ（９））
【注意事項】
・化学・生物学実験における一般的な注意事項、ならびにテキストの各々の箇所に記 載された注意事項を守ること。
・「遺伝子組換え生物な等の使用等の規制による生物の多様性の確保に関する法律 （2004年2月19日施行）」および関連規制・省令を守ること。特に、以下の点に留 意すること。
→遺伝子組換え生物等を含む廃棄物（廃液を含む。以下に同じ。）については、廃 棄の前に遺伝子組換え生物等を不活化するための措置を講ずること（第二種省令 第4条第1号別表第２ﾛ（1））
→実験台については、実験を行った日における実験の終了後、及び遺伝子組換え生物 などが付着したときは直ちに、遺伝子組換え生物等を不活化するための措置を講ず ること（同ﾛ（３））
→実験室の扉については、閉じておくこと（実験室に出入りするときを除く。）（同ﾛ （４））
→遺伝子組換え生物等を取り扱うものに当該遺伝子組換え生物などが付着し、又は感 染することを防ぐ為、遺伝子組換え生物などの取り扱い後における手洗いなど必要 な措置を講ずること。（同ﾛ（８））
→実験の内容を知らないものが、みだりに実験室に立ち入らないための措置を講ずる こと（同ﾛ（９））
・サンプル、ならびに配布した試薬等は実験の複数の箇所で使用する。必要なサンプ ル・試薬等を実験途中で処分してしまわないように、予めテキストを熟読して実験 計画を把握しておくこと。
・本実験には、紫外線ランプを使用する実験が含まれている。紫外線から目を保護す るためにUVカットゴーグルを着用し、ランプの光を直接見ないように注意するこ と。現在、生協で販売されている安全メガネ（裸眼用、メガネ用）の紫外線カット 率は99.8％であるので、既に購入済みの者は持参すること。
・本実験には、紫外線ランプを使用する実験が含まれている。紫外線から目を保護す るためにUVカットゴーグルを着用し、ランプの光を直接見ないように注意するこ と。現在、生協で販売されている安全メガネ（裸眼用、メガネ用）の紫外線カット 率は99.8％であるので、既に購入済みの者は持参すること。
1.2試薬・器具の準備
- マイクロチューブ、チップ（200μl、１ml）、爪楊枝、粉末LB培地、寒天、プラスチ ックシャーレ
- 50mg/mlアンピシリン溶液：350μl/マイクロチューブ、1本/実験台（冷凍保存）
- マイクロチューブ：ビーカーに入れ、アルミホイルで蓋をして、オートクレーブで滅 菌（120℃、20分間）する。蓋に、班名を標記しておく。
- チップ（200μl、１ml）：ラックに詰め、アルミホイルで包んでオートクレーブ滅菌 する。班名を標記しておく。
- 爪楊枝：ビーカーに入れ、アルミホイルで蓋をして、オートクレーブ滅菌する。蓋 に、班名を標記しておく。
- LB培地（寒天培地）：
ブラシノライどん(p16～p23)
【PCR産物の精製】
① 新しいマイクロチューブの蓋に班名を標記し、PCRチューブ”後+”中の反応液
（残り40μｌ）を移す。
② TE buffer（110μｌ）を加えて液量を150μｌとする。
③ ②のチューブにPhOH/CHCl3/IAA 150μｌを加え、ボルテックスミキサーで混合す
る。
④ 遠心分離（14,000 rpm、 室温、5min）を行う。
⑤上層（水層）を新しいマイクロチューブに回収する。このとき、中間層（変性タンパク質）や下層（有機層)を吸い込まないように注意すること。《注》下層は含水有機廃液として処分する。
⑥3M NaOAc 15μl（1/10量）を加えて混合する。
⑦EtOH 300μｌ（2倍量）を加えて混合し、室温で10分放置する。
⑧遠心分離（14,000 rpm、 4℃、15min）を行う。
⑨沈殿を目視し、沈殿を吸い込まないように注意しながら上清を除去する。
⑩70%EtOH 200μｌを加え、沈殿とチューブ壁を穏やかに洗う。
⑪遠心分離（14,000 rpm、 4℃、5min）を行う。
⑫上清を完全に除去した後、沈殿を風乾する。
【PCR産物の精製】
① 新しいマイクロチューブの蓋に班名を標記し、PCRチューブ”後+”中の反応液
（残り40μｌ）を移す。
② TE buffer（110μｌ）を加えて液量を150μｌとする。
③ ②のチューブにPhOH/CHCl3/IAA 150μｌを加え、ボルテックスミキサーで混合す
る。
④ 遠心分離（14,000 rpm、 室温、5min）を行う。
⑤上層（水層）を新しいマイクロチューブに回収する。このとき、中間層（変性タンパク質）や下層（有機層)を吸い込まないように注意すること。《注》下層は含水有機廃液として処分する。
⑥3M NaOAc 15μl（1/10量）を加えて混合する。
⑦EtOH 300μｌ（2倍量）を加えて混合し、室温で10分放置する。
⑧遠心分離（14,000 rpm、 4℃、15min）を行う。
⑨沈殿を目視し、沈殿を吸い込まないように注意しながら上清を除去する。
⑩70%EtOH 200μｌを加え、沈殿とチューブ壁を穏やかに洗う。
⑪遠心分離（14,000 rpm、 4℃、5min）を行う。
⑫上清を完全に除去した後、沈殿を風乾する。
1.5GFP遺伝子のプラスミドへの組み込みと大腸菌の形質転換
1.5.1はじめに
プラスミドはバクテリアの中で染色体とは独立して自己複製が可能な比較的小さな環状DNAである。遺伝子工学において、プラスミドはベクター（運び屋）として利用される。目的遺伝子（外来DNA）をプラスミドに組み込んで大腸菌に取り込ませれば、大腸菌の増殖にともなって目的遺伝子を増幅させることができる。また、適切なプラスミドを選択することで、外来遺伝子によってコードされるタンパク質を大腸菌や動植物細胞で生産させることができる。
プラスミドへの外来DNAの取り組みには、制限酵素が利用される。本実験で使用する制限酵素ｋｐｎ ｌとEcoRIは、それぞれ次のような塩基配列を認識・切断する。
プラスミド（ベクター）とPCR産物（インサート）の両方をこれらの制限酵素で切断することで、互いに連結可能な粘着末端（のりしろ）を生じる。DNAリガーゼを用いてベクターとインサートを連結させた（ライゲーション）後、大腸菌を形質転換（トランスフォーメーション)する。その際、通常の大腸菌はDNAを取り組みにくいため、CaCl2などで処理することによって細胞膜に穴を開け、DNAを取り込みやすい状態にしたもの（コンピテント細胞）を使用する。
1.5.1はじめに
プラスミドはバクテリアの中で染色体とは独立して自己複製が可能な比較的小さな環状DNAである。遺伝子工学において、プラスミドはベクター（運び屋）として利用される。目的遺伝子（外来DNA）をプラスミドに組み込んで大腸菌に取り込ませれば、大腸菌の増殖にともなって目的遺伝子を増幅させることができる。また、適切なプラスミドを選択することで、外来遺伝子によってコードされるタンパク質を大腸菌や動植物細胞で生産させることができる。
プラスミドへの外来DNAの取り組みには、制限酵素が利用される。本実験で使用する制限酵素ｋｐｎ ｌとEcoRIは、それぞれ次のような塩基配列を認識・切断する。
プラスミド（ベクター）とPCR産物（インサート）の両方をこれらの制限酵素で切断することで、互いに連結可能な粘着末端（のりしろ）を生じる。DNAリガーゼを用いてベクターとインサートを連結させた（ライゲーション）後、大腸菌を形質転換（トランスフォーメーション)する。その際、通常の大腸菌はDNAを取り組みにくいため、CaCl2などで処理することによって細胞膜に穴を開け、DNAを取り込みやすい状態にしたもの（コンピテント細胞）を使用する。
R(p24～p31）
1.7 プラスミドDNAの調整と解析
1.7.1はじめに
ここでは，アルカリ-SDS法によるプラスミドの調整法，ならびに制限酵素を用いたプラスミドの解析法について学ぶ．大腸菌を高pH下，SDSで処理すると，溶菌に続いてタンパク質の変性，DNAの編成（塩基対間の水素結合の切断）が起こる．この変性は，直鎖状の染色体DNAに対して，再会合不可能な相補鎖の解離を引き起こす．一方，超らせん構造をとる閉環状プラスミドの相補佐は，塩基対間の結合が切断されても物理的に会合しており，溶液のpHを中性に戻すことによって再び元の塩基対間結合が再生する．遠心分離によって，変性したタンパク質と染色体DNAの凝集魂を沈殿させることで，プラスミドは上清に回収される．
1.7.2試薬・器具等一覧
1.7 プラスミドDNAの調整と解析
1.7.1はじめに
ここでは，アルカリ-SDS法によるプラスミドの調整法，ならびに制限酵素を用いたプラスミドの解析法について学ぶ．大腸菌を高pH下，SDSで処理すると，溶菌に続いてタンパク質の変性，DNAの編成（塩基対間の水素結合の切断）が起こる．この変性は，直鎖状の染色体DNAに対して，再会合不可能な相補鎖の解離を引き起こす．一方，超らせん構造をとる閉環状プラスミドの相補佐は，塩基対間の結合が切断されても物理的に会合しており，溶液のpHを中性に戻すことによって再び元の塩基対間結合が再生する．遠心分離によって，変性したタンパク質と染色体DNAの凝集魂を沈殿させることで，プラスミドは上清に回収される．
1.7.2試薬・器具等一覧
- 大腸菌の懸濁液 “白1”～“白4”“青1”“青2”（1.6.3参照）
- LB液体培地(5ml)が入った試験管6本(1.2参照)
- 50mg/mlアンピシリン溶液：前出(1.2)
- Sol.I(50mMグルコース，25mMトリス-塩酸(pH8.0),10mM EDTA):1.4ml/マイクロチューブ，1本/実験台
1.8組換え型GFPの生産と解析
1.8.1はじめに
ここまでの実験で，目的のプラスミドpBluescript II-GFPを持ち，紫外線下で鮮やかな緑色蛍光を発するという新しい“形質”を獲得したクローンが同定できたことと思う．DNA供与対（蛍光バクテリア）が有していたGFP遺伝子を導入することで大腸菌がこのような新しい形質を獲得したのは，GFP遺伝子の塩基配列情報に基づいて，大腸菌(宿主)の中でGFPタンパク質(組み換え型GFP)が生産されたためである．このようなことが可能なのは，生物が，DNA→RNA→タンパク質→特徴・性質という共通した分子機構の上に成り立っているからである．ここでは，SDS-PAGEを用いて組み換え型GFPを解析する．
1.9組換え体の処分など
本実験で作成した組換え体，ならびに組換え体が付着したチップ，チューブ，プレート等は，全てオートクレーブ処理(組換え体の不活化)を行った後に廃棄する．実験台は70%エタノールを噴きかけて殺菌し，ペーパータオルで拭き取っておく．手を石けんなどでよく洗って実験を終了する．
1.8.1はじめに
ここまでの実験で，目的のプラスミドpBluescript II-GFPを持ち，紫外線下で鮮やかな緑色蛍光を発するという新しい“形質”を獲得したクローンが同定できたことと思う．DNA供与対（蛍光バクテリア）が有していたGFP遺伝子を導入することで大腸菌がこのような新しい形質を獲得したのは，GFP遺伝子の塩基配列情報に基づいて，大腸菌(宿主)の中でGFPタンパク質(組み換え型GFP)が生産されたためである．このようなことが可能なのは，生物が，DNA→RNA→タンパク質→特徴・性質という共通した分子機構の上に成り立っているからである．ここでは，SDS-PAGEを用いて組み換え型GFPを解析する．
1.9組換え体の処分など
本実験で作成した組換え体，ならびに組換え体が付着したチップ，チューブ，プレート等は，全てオートクレーブ処理(組換え体の不活化)を行った後に廃棄する．実験台は70%エタノールを噴きかけて殺菌し，ペーパータオルで拭き取っておく．手を石けんなどでよく洗って実験を終了する．
- では、みなさんがんばりましょう♪ -- ブラシノライどん (2006-07-03 20:57:19)
- アルファベットと数字にはうんざりです☆ ところでこれ本当に要るの？ -- R (2006-07-03 21:35:23)
- やっぱりそう思う？おいらも昨日そう思って朝、聞いたんだよね・・・ -- ブラシノライどん (2006-07-03 21:58:12)
- でもまぁ いるという事で -- ブラシノライどん (2006-07-03 21:59:05)
- こんなのを読んでみては・・・http://www2.odn.ne.jp/~cdu37690/gakkounokumikaejikken.htm -- ブラシノライどん (2006-07-06 20:13:30)
- ちなみにこれがGFPらしいです。http://www.expasy.org/cgi-bin/view-pdb?pdb=1ema -- ブラシノライどん (2006-07-06 20:39:41)
- IPTGってGFPの発現を誘導する効果もあるんだよね？ -- ブラシノライどん (2006-07-07 14:14:38)
- ＧＦＰってなんだか複雑な形をしてるのね -- エチレモン (2006-07-07 23:34:20)
- 実験方法は過去形（AにBを加えて何々した。）で書けっていってたけど、過去形で書くとなんかへんじゃない？ -- エチレモン (2006-07-31 14:15:56)
- 植物コースで出回っているのもゲットしたので参考に・・・・。コピペすると他の人も困るのでよろしく。 -- ブラシノライどん (2006-08-01 10:10:45)
- ちょっと待って エラーが出てる -- ブラシノライどん (2006-08-01 10:15:14)
- やっぱできない、3Mはでかいな。分割するね -- ブラシノライどん (2006-08-01 10:18:30)
- できたーーよろしく -- ブラシノライどん (2006-08-01 10:23:06)
- 片対数グラフとか分子量求めるのとかやったほうがいいのか？ -- エチレモン (2006-08-02 23:31:45)
- やらなくていいと思う。TAいわく去年はもっと時間があって詳しく教えていたらしい・・・。 -- ブラシノライどん (2006-08-03 10:52:40)
