【LB液体培地の作製】
250 ml × 2本
500 ml フラスコ(バッフル付き)に注ぎ、キャップとともにオートクレーブ。
250 ml × 2本
500 ml フラスコ(バッフル付き)に注ぎ、キャップとともにオートクレーブ。
【形質転換】
BL21(DE3)pLysSを氷上に置き溶かす。
①VH(DiAcSpd)-PhoA/pET、
②MBP-VL(DiAcSpd)/pETを加え、軽く混合。
On ice for 30 min
ヒートショック(42℃、45 sec)
直ちに氷上に戻し、1〜2 min静置。
SOC液体培地を200 ul 加える。
37℃、30 min Curing
①、②、それぞれLBAC寒天培地にプレーティング。
37℃、o/n
BL21(DE3)pLysSを氷上に置き溶かす。
①VH(DiAcSpd)-PhoA/pET、
②MBP-VL(DiAcSpd)/pETを加え、軽く混合。
On ice for 30 min
ヒートショック(42℃、45 sec)
直ちに氷上に戻し、1〜2 min静置。
SOC液体培地を200 ul 加える。
37℃、30 min Curing
①、②、それぞれLBAC寒天培地にプレーティング。
37℃、o/n
【4 ml培養】
それぞれ、LBAC(1% Glucose) 4 mlに植菌
37℃振盪培養、o/n
それぞれ、LBAC(1% Glucose) 4 mlに植菌
37℃振盪培養、o/n
【250 ml培養】
それぞれ、LBAC 250 mlに植菌
27℃ 振盪培養、数時間
O.D.が0.4〜0.6になったら、IPTG (終濃度0.4 mM) を添加して発現誘導。
27℃ 振盪培養、o/n
それぞれ、LBAC 250 mlに植菌
27℃ 振盪培養、数時間
O.D.が0.4〜0.6になったら、IPTG (終濃度0.4 mM) を添加して発現誘導。
27℃ 振盪培養、o/n
【集菌】
培養液を遠心管に移し、バランスを合わせる。
4℃、6000 g 10 min遠心。上清と菌体ペレットに分離する。
培養液を遠心管に移し、バランスを合わせる。
4℃、6000 g 10 min遠心。上清と菌体ペレットに分離する。
【硫安沈殿】
培養上清はビーカーに回収し、回転子を入れ、氷上にて保存。
硫酸アンモニウム107 g を秤量し、乳鉢ですり潰す。
細かな粉末にしたら、ビーカーに撹拌しながら少しずつ加えていく。
4℃、数時間〜１晩、静置。
↓
遠心管に移し、バランスを合わせる。(充填量に注意)
4℃、10000 g 、10 min遠心。
上清はもとのビーカーに戻し、オートクレーブして廃棄。
TALONバッファ10 mlで沈殿を再懸濁し、ファルコンに移して４℃保存。
↓精製過程へ
培養上清はビーカーに回収し、回転子を入れ、氷上にて保存。
硫酸アンモニウム107 g を秤量し、乳鉢ですり潰す。
細かな粉末にしたら、ビーカーに撹拌しながら少しずつ加えていく。
4℃、数時間〜１晩、静置。
↓
遠心管に移し、バランスを合わせる。(充填量に注意)
4℃、10000 g 、10 min遠心。
上清はもとのビーカーに戻し、オートクレーブして廃棄。
TALONバッファ10 mlで沈殿を再懸濁し、ファルコンに移して４℃保存。
↓精製過程へ
【Osmotic shock】
菌体ペレットを、以下の組成の試薬30 ml で再懸濁。
菌体ペレットを、以下の組成の試薬30 ml で再懸濁。
30 mM Tris-HCL 20% Sucrose pH 8.0
0.5 M EDTA 60 ulを加える。
10 min 回転、r.t.
8000 g 10 min 遠心。上清除去。
5 mM MgSO4 (氷冷) 30 mlを加える。
10 min 回転、4℃
8000 g 10 min遠心。
上清回収 (Osmotic solution)
↓精製過程へ
10 min 回転、r.t.
8000 g 10 min 遠心。上清除去。
5 mM MgSO4 (氷冷) 30 mlを加える。
10 min 回転、4℃
8000 g 10 min遠心。
上清回収 (Osmotic solution)
↓精製過程へ
【SDS-PAGE】
ガラス器具を扱うときは手袋着用。最初にエタノールでガラス板等を磨く。
アクリルアミドゲル作製(10%)
１枚あたり Lower gel Upper gel
アクリルアミドゲル作製(10%)
１枚あたり Lower gel Upper gel
30% アクリルアミド 3.3 ml 450 ul ゲルバッファ 2.5 ml 750 ul milliQ 4.2 ml 1.8 ml 20% APS 50 ul 12.5 ul TEMED 6.5 ul 3.5 ul total 10 ml 3 ml
APS、TEMEDは最後に加え、数回上下反転させて穏やかに混合し、型に流し込む。
(Lower gel) イソプロパノールを重層させる。
(Upper gel) コームを差し込んでウェルを作る。
固まったら泳動層を組み立てる。
(Lower gel) イソプロパノールを重層させる。
(Upper gel) コームを差し込んでウェルを作る。
固まったら泳動層を組み立てる。
サンプルバッファ 9 ul メルカプトエタノール 1 ul ×サンプル数(+α) 調製 ・・・① total 10 ul
サンプル 10 ul ① 10 ul 調製 total 20 ul
95℃、5 min、ボイル。
ウェルにアプライして泳動 (マーカーは10 ul)
ウェルにアプライして泳動 (マーカーは10 ul)
ゲルを染色する(Quick CBB+)
milliQ 5 min × 3回
QCBB+ 45〜60 min
milliQ 5 min × 3回
milliQ 5 min × 3回
QCBB+ 45〜60 min
milliQ 5 min × 3回
ゲルを乾燥させる。
【Bradford Assay】
検量線として、BSA 400,200,100,50,0 ug/mlをそれぞれ用意する。
検量線として、BSA 400,200,100,50,0 ug/mlをそれぞれ用意する。
サンプル 10 ul milliQ 150 ul Bradford溶液 40 ul total 200 ul
96 well マイクロプレート上で、milliQ、サンプル、Bradford溶液、の順に加え、
よくピペッティングした後数分間常温で静置し、波長595 nm の吸光度を測定する。
よくピペッティングした後数分間常温で静置し、波長595 nm の吸光度を測定する。
