＜シーケンス確認＞
★ プラスミドの配列を確認する
★ プラスミドの配列を確認する
PCR
1.プラスミド調整
Milli Q 5 μl プラスミド 1 μl（0.2 μgくらい） total 6 μl
※テンプレート量は50~70 fmolが目安。プラスミド量が適性ならばシーケンス解析時の最初のピークが20 min前後で現れる。濃度が濃すぎると30 minくらいになる（らしい）。
2.プレヒート処理（PCR産物で行う際は必要ない）
サーマルサイクラー使用
サーマルサイクラー使用
96℃ 1 min 1 cycle 25℃ ∞
でプレヒート。終了後、軽く遠心して水滴を落とす。
3. PCR用サンプル調整（？？要確認？？）
Master mix (on ice) 2μl 5×Sequence buffer 1μl Primer (1.6 pmol/μl) 1μl ×サンプル数分（+α）
を作製し、先ほどのプラスミドMix(6μl)に4μlずつ分注する。これでトータル10μl。
4. dideoxy 伸長反応
96℃ 5 min 1 cycle 96℃ 30sec 50℃ 15sec 60℃ 2~4 min 35 cycle（30cycleでも多分大丈夫） 15℃ ∞
でPCRを行う。
精製
1.エタ沈
3M CH3COONa 1μl 100mM EDTA 1μl Glycogen (-20℃保存) 0.5 μl ×サンプル数分（+α）
を調整。1.5mlエッペンに2.5μlずつ分注。
伸長反応液10μlを加える。これでトータル12.5μl。
伸長反応液10μlを加える。これでトータル12.5μl。
2.
- 20℃ 100% EtOH 30μlを加え、ボルテックス後、遠心（15000rpm, 30 min）。
※ここの工程は1 min以内に行う。
3. 上清をピペットマンで除去
4. wash×2
-20℃ 70% EtOH 100μlを加え（混ぜない）、遠心（15000rpm, 2 min）。上清をピペットマンで除去。を、全部で二回やる。
-20℃ 70% EtOH 100μlを加え（混ぜない）、遠心（15000rpm, 2 min）。上清をピペットマンで除去。を、全部で二回やる。
5. バキューム乾燥遠心3~5 min
※乾燥遠心機は温度が上がらないように、Drying Rateは必ずLowにする。高温厳禁。引き出しの中で10~15 min静置でもいいらしい？
※乾燥遠心機は温度が上がらないように、Drying Rateは必ずLowにする。高温厳禁。引き出しの中で10~15 min静置でもいいらしい？
6. sample loading solution 25μlに溶かす。ペレットがなくなるまでピペッティング。根性。
※ボルテックス 1 min、その後軽くピペッティング、、、でもいけるという噂あり
※ボルテックス 1 min、その後軽くピペッティング、、、でもいけるという噂あり
7. サンプルプレート（白で半透明の底がとがった96穴プレート）のレーン（例 1-A, 1-B, 1-C, 1-D, 1-E, 1-F, 1-G, 1-H のように一回で横一列使用）にサンプル25μlアプライ。ブランクにはsample loading solution 25μlをアプライ。
8. サンプルの上にミネラルオイル（BECHMAN COULTER MINERAL OIL）を一滴滴下。側面に沿わせるようにする。ブランクにも一応やっておく。
9. バッファープレート（底が平らで透明なプレート）のサンプルに対応するレーンにバッファー（4℃保存のCEQ SEPARATION BUFFER BECHMAN COULTER）を8分目まで滴下。
遺伝子解析システムCEQ 8000 (Beckman Coulter) にて配列解析。
