CDC 2019-novel コロナウイルス（2019-nCoV）リアルタイムRT-PCR診断パネル

PCR検査

（※mono....下記リンク先の英文の主な場所をDeepL機械翻訳しました。Google翻訳は怪しいので使いません。）
■　CDC 2019-Novel Coronavirus (2019-nCoV） Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel

緊急時のみ

使用方法

カタログ番号 2019-nCoVEUA-01
1000反応

体外診断（IVD）用
Rxのみ

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使用目的

CDC 2019-novel コロナウイルス（2019-nCoV）リアルタイム RT-PCR 診断パネルは、上部および下部呼吸器検体（鼻咽頭または咽頭スワブ、喀痰、下気道吸引、気管支肺胞ラベージなど）の 2019-nCoV からの核酸の定性検出を目的としたリアルタイム RT-PCR 検査です。および鼻咽頭洗浄／吸引液または鼻腔吸引液）は、2019-nCoV の臨床および／または疫学的基準（例えば、2019-nCoV 感染に関連する臨床徴候および症状、2019-nCoV 症例の可能性が高いまたは確認された 2019-nCoV 症例との接触、2019-nCoV 症例が検出された地理的な場所への旅行歴、または公衆衛生調査の一環として 2019-nCoV 検査が指示される可能性があるその他の疫学的関連性）を満たす個人から採取されたものである。米国での検査は、1988年臨床検査改善法改正（CLIA）、42 U.S.C.§263aの下で、複雑度の高い検査を実施することを認定された検査施設に限定されている。

結果は2019-nCoV RNAの同定のためのものです。2019-nCoV RNAは、一般的に感染中の上部呼吸器検体および下部呼吸器検体で検出可能である。陽性の結果は2019-nCoVの活発な感染を示しますが、細菌感染や他のウイルスとの共感染を排除するものではありません。検出された病原体が病気の決定的な原因ではない可能性があります。陰性結果は2019-nCoV感染を排除するものではなく、治療や他の患者管理の決定のための唯一の根拠として使用すべきではありません。陰性結果は、臨床観察、患者の病歴、疫学的情報と組み合わせなければならない。 CDC 2019-nCoV リアルタイム RT-PCR 診断パネルを用いた検査は、リアルタイム RT-PCR アッセイの実行に精通した訓練を受けた検査室の担当者による使用を意図しています。CDC 2019-novel Coronavirus (2019-nCoV) Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel は、食品医薬品局（Food and Drug Administration）の緊急使用許可の下でのみ使用できます。

概要と説明

中国湖北省武漢市で発生した原因不明の肺炎のアウトブレイクは、2019年12月31日にWHOに初報告されました。中国当局は新型コロナウイルス（2019-nCoV）を同定し、世界的に数百万人のヒトへの感染が確認されています。無症状感染、軽症、重症、死亡例が報告されています。CDC 2019-nCoVリアルタイムRT-PCR診断パネルは、2019-nCoVの検出と診断を助ける分子in vitro診断テストであり、広く使用されている核酸増幅技術に基づいています。本製品は、呼吸器検体中の2019-nCoV RNAのin vitro定性検出のためのrRT-PCRで使用されるオリゴヌクレオチドプライマーおよびデュアルラベル加水分解プローブ（TaqMan®）とコントロール材料を含んでいます。用語「適格試験所」とは、すべてのユーザー、分析者、および本装置の使用による結果を報告する者が、使用前に有能な指導者によって本手順の実行および解釈の訓練を受けている試験所を意味します。

手続きの原則

2019-nCoVを検出するためのオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブは、ウイルスヌクレオカプシド（N）遺伝子の領域から選択された。パネルは、2019-nCoVを特異的に検出するために設計されている（２つのプライマー／プローブセット）。コントロールサンプルおよび臨床検体中のヒトRNase P遺伝子（RP）を検出するための追加のプライマー／プローブセットもまた、パネルに含まれている。上部および下部呼吸器検体から単離および精製されたRNAは、cDNAに逆転写され、その後、アプライド・バイオシステムズ社の7500 Fast Dx Real-Time PCR Instrument（SDSバージョン1.4ソフトウェア付き）で増幅される。この過程で、プローブは、順方向プライマーと逆方向プライマーの間に位置する特定の標的配列にアニーリングします。 PCRサイクルの延長段階では、Taqポリメラーゼの5'ヌクレアーゼ活性がプローブを分解し、レポーター色素がクエンチャー色素から分離して蛍光シグナルを発生させます。各サイクルで、追加のレポーター色素分子がそれぞれのプローブから切断され、蛍光強度が増加します。蛍光強度は、SDSバージョン1.4ソフトウェアを使用したApplied Biosystems 7500 Fast Dx Real-Time PCR Systemにより、各PCRサイクルでモニターされる。ウイルスRNAの検出は、病気の診断を助けるだけでなく、疫学的およびサーベイランス情報を提供します。

準備・試験工程の概要
※mono....図略

必要な材料（提供）
※mono....略

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カタログ#VTC-04 CDC 2019-nCoV Positive Control (nCoVPC)ReagentLabelPart #DescriptionQuantityNotesnCoVPCRV2020052019-nCoV Positive Control (nCoVPC) CDC 2019-nCoV Real-Time RT-PCR Diagnostic Panelprocedure のポジティブコントロールとして使用します。nCoVPCは、乾燥状態で供給される非感染性のポジティブコントロール材料を含み、使用前に再懸濁されなければなりません。4本のチューブは、(800) 5μLのテスト反応を提供します。必要な材料 (ただし、提供されていません) Human Specimen Control (HSC) DescriptionQuantityCDC Catalog No.Manufactured by CDC。核酸の回収に成功したことを示すための核酸抽出手順コントロールとしての使用のために、抽出試薬の完全性と同様に。HSCは、非感染性（β-プロピオラクトン処理）の培養ヒト細胞を0.01MのPBSに懸濁液として供給し、pH7.2～7.4で処理したものです。10バイアル×500uLKT0189HSCへの許容可能な代替品：-陰性のヒト検体材料。検査室は、抽出コントロールとして臨床サンプルと一緒に抽出し、実行するためのヒト検体（例えば、ヒト血清またはプールされた陰性呼吸器検体）を準備してもよい。この検体は、複数の検査にまたがって使用できるように十分な量を用意すべきである。抽出対照として使用する前に、本使用説明書に記載されているHSCに対して期待される結果が得られることを確認するために、抽出対照として使用する前に材料を試験すべきである。模倣ヒト標本材料：研究室では、任意のヒト細胞株（例えば、A549、Hela、または293）をPBSに懸濁させることにより、模倣ヒト標本材料を調製することができる。この材料は、複数のランにまたがって使用するのに十分な量で調製されるべきである。抽出コントロールとして使用する前に、これらの使用説明書に記載されている HSC に対して期待される結果が得られることを確認するために、材料をテストする必要があります。CDCは、CDCの緊急使用許可の下で本試験法での使用が認められている場合には、商業的に代替となる抽出コントロールのリストをウェブサイトに掲載します。
https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-nCoV/lab/virus-requests.html

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※mono....以下は気になる文章を拾った

陽性・陰性の予測値は有病率に大きく依存する。疾患の有病率が高い場合、偽陰性の検査結果が出やすい。偽陽性の検査結果は、有病率が中等度から低度の場合に起こりやすくなります。（38/59）
ウイルスがrRT-PCR標的領域で変異した場合、2019-nCoVは検出されないか、または予測しにくく検出される可能性があります。阻害剤や他のタイプの干渉により、偽陰性の結果が得られる可能性があります。感冒薬の効果を評価する干渉試験は実施していません。(同上)
ウイルスRNAの検出は、感染性ウイルスの存在を示すものではなく、また2019-nCoVが臨床症状の原因物質であることを示すものではない場合がある。（39/59）
この検査の性能は、2019-nCoV感染症の治療をモニタリングするためには確立されていない。（39/59）
2019-nCoVの存在を確認するための血液又は血液製剤のスクリーニングには、本検査の性能は確立されていません。（39/59）
本検査は、他の細菌性またはウイルス性病原体による疾患を除外することはできません。

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性能特性
LoD研究は、すべての（真陽性の）レプリケートの約95％が陽性である2019-nCoVの最低検出濃度を決定します。 LoDは、特徴のあるサンプルを使用した限界希釈試験によって決定されました。

CDC 2019 Novel Coronavirus (2019-nCoV) Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel に含まれる rRT-PCR アッセイの分析感度は、検出限界試験で決定した。2019-nCoVの定量化されたウイルス単離体は現在利用できないため、2019-nCoV RNAの検出のために設計されたアッセイは、既知の力価（RNAコピー/μL）のin vitro転写全長RNA（N遺伝子、GenBank accession: MN908947.2）の特徴的なストックを、ヒトA549細胞の懸濁液とウイルス輸送培地（VTM）からなる希釈液にスパイクして、臨床検体を模倣して試験した。サンプルは、QIAGEN EZ1 Advanced XL装置とEZ1 DSPウイルスキット（Cat# 62724）を使用して抽出し、QIAGEN DSPウイルスRNAミニキット（Cat# 61904）を使用して手動で抽出した。リアルタイムRT-PCRアッセイは、CDC 2019-nCoVリアルタイムRT-PCR診断パネルの使用説明書に従って、Applied Biosystems™ 7500 Fast DxリアルタイムPCR装置上のThemoFisher Scientific TaqPath™ 1-Step RT-qPCR Master Mix, CG (Cat# A15299)を使用して実施した。

各アッセイの予備的なLoDは、各抽出方法を使用して精製されたRNAの3つのサンプルを試験して決定されました。およそのLoDは、in vitroで転写された完全長RNAの特徴的なストックの10倍の連続希釈液を抽出し、試験することによって同定されました。LoDの確認は、20個の抽出されたレプリケートを有する3倍シリアル希釈RNAサンプルを用いて決定した。LoDは、レプリケートの95％以上（19/20）が陽性であった最低濃度として決定された。（41/59）

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2019-nCoV_N2アッセイ。
2019-nCoV rRT-PCRアッセイN2の順方向プライマー配列は、Bat SARS様コロナウイルスと高い配列相同性を示した。逆方向のプライマーとプローブの配列は、ヒトゲノム、他のコロナウイルスまたはヒト微生物叢との有意な相同性を示さなかった。プライマーとプローブを組み合わせても、潜在的な偽陽性rRT-PCR結果の予測はできない。

要約すると、2019-nCoVの特異的検出のために設計された2019-nCoV rRT-PCRアッセイN1およびN2は、潜在的な偽陽性rRT-PCR結果を予測するようなヒトゲノム、他のコロナウイルス、またはヒトマイクロフローラとの有意な結合相同性を示さなかった。

インシリコ解析に加えて、いくつかの生物を抽出し、CDC 2019-nCoVリアルタイムRT-PCR診断パネルを用いて試験を行い、分析特異性と排他性を実証した。試験は、QIAGEN EZ1 Advanced XL装置およびEZ1 DSPウイルスキットを用いて抽出した核酸を用いて実施した。核酸は高力価製剤（通常は≥105PFU/mLまたは≥106CFU/mL）から抽出した。試験は、ThemoFisher Scientific TaqPath™ 1-Step RT-qPCR Master Mix, CGを使用して、Applied Biosystems™ 7500 Fast Dx Real-Time PCR装置で実施しました。データは、CDC 2019-nCoV リアルタイム RT-PCR 診断パネルを用いて試験した場合に、各生物について期待される結果が得られることを示しています。

表 8. CDC 2019-nCoV リアルタイム RT-PCR 診断パネルの特異性/除外性}

（※mono...上の表を使ってこちらサイトでは、「コロナウイルス、MERS、SARS、インフルエンザ、RSウイルスなど他のウイルスや細菌には反応しないとしっかりと書かれています」と言及。）
（※mono....上に表を見ると、「0/3」という数字が見える。これって何？3例しか調べていないということか？このペーパー内で、「本検査は、他の細菌性またはウイルス性病原体による疾患を除外することはできません」と注釈して置きながら、すべてがネガティブって…信用するに値するの？すべてがネガティブの症例を抽出し表にしたと思われても仕方がないのでは？）

内因性干渉物質の研究。

CDC 2019-nCoVリアルタイムRT-PCR診断パネルは、従来の確立された核酸抽出法を使用し、CDCの他のEUAアッセイの経験に基づいています。中近東呼吸器症候群コロナウイルス（MERS-CoV）の推定検出のための CDC Novel Coronavirus 2012 Real-time RT-PCR アッセイおよび新規インフルエンザ A（H7N9）ウイルスの推定検出のための CDC Human Influenza Virus Real-time RT-PCR Diagnostic Panel-Influenza A/H7 (Eurasian Lineage) Assay を含む、いずれも多くの呼吸器検体での使用を目的としており、共通の内因性物質による干渉は予想されていません。

検体の安定性と新鮮凍結試験

感染を検出する可能性を高めるために、CDC は検査のために下気道と上気道の検体を収集することを推奨しています。可能であれば、追加の検体（例：便、尿）を採取し、CDCが追加の検体源を検査すべきかどうかを決定するまでは、最初に保管しておくべきである。検体は、症状の発現にかかわらず、PUIが確認されたらできるだけ早く採取すべきである。検体採取時には適切な感染管理を維持する。検体は2～8℃で保存し、一晩かけて氷嚢に入れてCDCに出荷する。各検体容器には、患者のID番号（カルテ番号など）、固有の検体ID（検査依頼番号など）、検体の種類（鼻腔スワブなど）、検体採取日のラベルを貼る。提出された各検体について、CDCフォーム50.34を記入する。

mono....以下に重要と思われるデータがあるが、ちょっと休憩・・・・

www.DeepL.com/Translator（無料版）で翻訳しました。

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最終更新：2020年07月23日 12:47