MONOSEPIA
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（※mono....こちらの記事はWalk in the Spiritの記事より知る。）
■　Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 from Patient with Coronavirus Disease, United States　「CDC[アメリカ疾病予防管理センター]（Volume 26, Number 6—June 2020 ）」より
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機械翻訳しました。
重症急性呼吸器症候群 コロナウイルス病患者からのコロナウイルス2、米国
（※mono....文中の図は略、英文本文記事で確認を）

Jennifer Harcourt1, Azaibi Tamin1, Xiaoyan Lu, Shifaq Kamili, Senthil K. Sakthivel, Janna Murray, Krista Queen, Ying Tao, Clinton R. Paden, Jing Zhang, Yan Li, Anna Uehara, Haibin Wang, Cynthia Goldsmith, Hannah A. Bullock, Lijuan Wang, Brett Whitaker, Brian Lynch, Rashi Gautam, Craig Schindewolf, Kumari G. Lokugamage, Dionna Scharton, Jessica A. Plante, Divya Mirchandani, Steven G. Widen, Krishna Narayanan, Shinji Makino, Thomas G. Ksiazek, Kenneth S. Plante, Scott C. Weaver, Stephen Lindstrom, Suxiang Tong, Vineet D. Menachery2, and Natalie J. Thornburg2Comments to Author

著者の所属。疾病対策予防センター、アトランタ、ジョージア州、米国（J. Harcourt, A. Tamin, X. Lu, K. Queen, Y. Tao, C.R. Paden, Y. Li, C. Goldsmith, B. Whitaker, R. Gautam, S. Lindstrom, S. Tong, N.J. Thornburg）、イーグルメディカルサービス、アトランタ（S. Kamili, S.K. Sakthivel, J. Murray, B. Lynch）、IHRC、アトランタ（J. Zhang, H. Thornburg)、Eagle Medical Services, Atlanta (S. Kamili, S.K. Sakthivel, J. Murray, B. Lynch)、IHRC, Atlanta (J. Zhang, H. Wang)、Oak Ridge Institute for Science and Education, Oak Ridge, Tennessee, USA (A. Uehara)、Synergy America, Inc. アトランタ（H.A. Bullock, L. Wang）；テキサス大学医学部、ガルベストン、テキサス州、米国（C. Schindewolf, K.G. Lokugamage, D. Mirchandani, S. Widen, K. Narayanan, S. Makino, T.G. Ksiazek, S.C. K.C. Ksiazek、S.C.ウィーバー、V.D.メナチェリー）；World Reference Center for Emerging Viruses and Arboviruses, ガルベストン（D. Scharton, J.A. Plante, T.G. Ksiazek, K.S. Plante, S.C.ウィーバー、V.D.メナチェリー）。


抄録

中国・武漢で発生した肺炎アウトブレイクの病因は、2020年1月に重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2と特定された。2020年1月20日に米国の患者がワシントン州と米国疾病対策センターからこのウイルスに感染しているとの診断を受けた。この患者の鼻咽頭および口咽頭の検体からウイルスを分離し、ウイルスの配列、複製特性、細胞培養トロピズムを特徴付けた。その結果、トリプシン非存在下でベロCCL81細胞およびベロE6細胞でウイルスが高力価に複製することがわかった。また、このウイルスを2つのウイルスリポジトリに寄託し、公衆衛生や研究コミュニティで広く利用できるようにしました。本試薬のオープンアクセスにより、医療対策の開発が早まることを期待しています。

2019年後半に中国・武漢で発生した肺炎の発生源として、新型コロナウイルスである重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）が確認された（1,2）。このウイルスは、SARS-CoVやSARS関連のコウモリCoVと同種のβコロナウイルスファミリーの一員であることが判明した（3,4）。感染拡大のパターンから、SARS-CoV-2は人から人への感染が可能であり、SARS-CoVよりも感染性が高い可能性があることが示唆されている(5-7)。コロナウイルスのスパイク蛋白質は、ウイルスの結合と細胞内への侵入を媒介する。SARS-CoV-2スパイクの初期の特徴付けは、SARS-CoVアンジオテンシン変換酵素と同じ受容体に結合していることを示しており、これはヒトの上・下気道の両方に発現している(8)。

このアウトブレイクの前例のない急速な広がりは、標準試薬の決定的な必要性を表しています。公衆衛生の分野では、診断の参考となるウイルス溶解物が必要であり、研究の分野では、抗ウイルス化合物の試験、新しいワクチンの開発、および基礎研究を行うためのウイルス単離物が必要である。この論文では、米国のコロナウイルス病（COVID-19）患者からのSARS-CoV-2の単離を記述し、そのゲノム配列と複製特性を記述した。我々は、このウイルス単離物を2つのウイルス試薬リポジトリに寄託することで、公衆衛生コミュニティが利用できるようにした。

方法

標本の採取

患者サンプルからのウイルス分離は、疾病管理予防センター（CDC）の国立予防接種・呼吸器疾患センター（National Center for Immunizations and Respiratory Diseases）により、ヒトを対象とした研究ではないと判断された（研究決定番号：0900f3eb81ab4b6e）。中国への渡航中にCOVID-19を獲得し、米国ワシントンで同定された症例患者の臨床検体を、記載されているように収集した（1）。症状発現後3日目に鼻咽頭（NP）および口咽頭（OP）の綿棒検体を採取し、2～3mLのウイルス輸送培地に入れ、分子診断に使用した後、凍結した。PCR陽性が確認された検体は、ウイルス分離が開始されるまで分注し、再凍結した。

細胞培養、限界希釈、ウイルス分離

Vero CCL-81細胞の単離と初期継代には、Vero CCL-81細胞を用いた。Vero E6、Vero CCL-81、HUH 7.0、293T、A549、およびEFKB3細胞を、熱不活化ウシ胎児血清（5％または10％）および抗生物質/抗真菌剤（GIBCO、https://www.thermofisher.comExternal リンク）を補充したダルベッコミニマルエッセンシャル培地（DMEM）中で培養した。ウイルスの単離には、NPとOPの両方のスワブ検体を使用した。ウイルスの単離、限界希釈、および通過1については、96ウェル組織培養プレートのカラム2〜12に50μLの無血清DMEMをピペッティングし、次に100μLの臨床検体をカラム1にピペッティングし、プレート全体で2倍に連続的に希釈した。次に、10％ウシ胎児血清、2×ペニシリン／ストレプトマイシン、2×抗生物質／抗真菌剤、および2×アンホテリシンBを含むDMEM中のベロ細胞を2.5×105細胞／mLの濃度でトリプシン化し、再懸濁した。100μLの細胞懸濁液を臨床検体希釈液に直接添加し、ピペッティングで穏やかに混合した。次いで、接種した培養物を、５％ＣＯ２の雰囲気下で加湿した３７℃のインキュベーター中で増殖させ、毎日細胞病理学的効果（ＣＰＥ）を観察した。SARS-CoV-2については、SARS-CoVおよび中東呼吸器症候群コロナウイルス（MERS-CoV）プロトコル（9,10）に基づく標準的なプラークアッセイを使用した。

CPEが観察された場合には、ピペットチップの背で細胞単分子膜を掻き取った。確認試験およびシークエンスのための全核酸抽出には、50μLのウイルス溶解液を使用した。また、９０％コンフルエント２４ウェルプレートのウェルへの接種に５０μＬのウイルス溶解液を使用した。

包摂性・排他性テスト

CPE が観察されたウェルから、リアルタイム逆転写 PCR（CDC）とフルゲノムシークエンシング（1）を用いた確認試験を行った。CDC分子診断アッセイはヌクレオカプシド遺伝子の3つの部分を標的としており、3つの部分すべてが陽性でなければ陽性とは言えない（https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/rt-pcr-detection-instructions.html および https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/rt-pcr-panel-primer-probes.html）。他の呼吸器ウイルスが存在しないことを確認するために、Fast Track Respiratory Pathogens 33 検査（FTD Diagnostics, http://www.fast-trackdiagnostics.com）を実施した。

全ゲノムシークエンシング

コロナウイルスの参照配列（GenBank accession no. NC045512）に基づいて、ゲノムにまたがる37対のネストドPCRを設計した。分離物から核酸を抽出し、３７個の個別のネストしたＰＣＲを用いて増幅した。陽性ＰＣＲアンプリコンを個別に使用し、その後のＳａｎｇｅｒシークエンシングに使用し、また、ライゲーションシークエンシングキット（オックスフォードナノポアテクノロジーズ、https://nanoporetech.comExternal リンク）を使用してライブラリー調製のためにプールし、その後、オックスフォードナノポアＭｉｎＩＯＮシークエンシングに使用した。Minimap version 2.17 (https://github.comExternal Link)とSamtools version 1.9 (http://www.htslib.orgExternal Link)を用いて、コンセンサス配列を生成した。また、Sequencher version 5.4.6 (https://www.genecodes.comExternal Link)を用いて両方向からSangerシーケンシングでコンセンサス配列を生成し、ナノポアシーケンシングで生成したコンセンサス配列を用いてさらに確認した。

パッセージ４のストックを配列決定するために、Next Ultra II RNA Prep Kit（New England Biolabs、https://www.neb.comExternal Link）を用いて、メーカーのプロトコルに従って配列決定用のライブラリーを調製した。簡単に言えば、我々は、cDNA合成、末端修復、およびアダプターライゲーションに続いて、15分間、RNAの≈70〜100 ngを断片化した。PCRの6ラウンド後、Agilent Bioanalyzer（https://www.agilent.comExternal リンク）を用いてライブラリーを分析し、定量PCRを用いて定量した。サンプルをプールし、Illumina (Illumina, Inc., https://www.illumina.comExternal Link) MiniSeq装置上でペアエンド75塩基プロトコルを使用し、High-Output Kitを使用して、サンプルをシークエンスし、その後、Trimmomaticバージョン0.36 (11)を使用してリードを処理して、低品質の塩基呼び出しおよび任意のアダプター配列を除去した。我々は、de novoアセンブリプログラムABySS（12）を使用して、リードのいくつかの異なるセットと20から40の範囲のkmer値を使用して、リードをコンティグにアセンブルしました。我々は、BLASTを使用して、National Center for Biotechnology Information（米国メリーランド州ベセスダ）のヌクレオチドコレクションと400塩基以上のコンティグを比較しました（https://blast.ncbi.nlm.nih.govExternal リンク）。各サンプルで得られたほぼ完全長のウイルスコンティグは、2019-nCoV/USA-WA1/2020株（GenBank accession no. MN985325.1）と100％の同一性を有していた。残りのすべてのコンティグは、宿主細胞のrRNAまたはミトコンドリアのいずれかにマッピングした。トリミングしたリードをBWAバージョン0.7.17（13）を用いて参照配列にマッピングし、統合ゲノミクスビューア（14）を用いてこれらのリードを可視化し、USA-WA1/202020株との同一性を確認した。

電子顕微鏡

我々は、フラスコから感染したベロ細胞をスクレイプし、低速遠心分離によってペレット化し、0.1 mol/Lリン酸緩衝液で洗浄し、再びペレット化し、2.5％緩衝グルタルアルデヒドで2時間固定した。次に、1％オスミウムテトロキシドで後固定した標本を、4％酢酸ウラニルでエンブロック染色し、脱水し、エポキシ樹脂に埋め込んだ。極薄切片を切断し、酢酸ウラニル4%とクエン酸鉛で染色し、サーモフィッシャー/FEI Tecnai Spirit電子顕微鏡(https://www.fei.com)を用いて調べた。

タンパク質分析とウエスタンブロッティング

2% SDSおよび5% β-メルカプトエタノールを含むLaemmliドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動サンプルバッファー（Bio-Rad、https://www.bio-rad.comExternal リンク）を用いて細胞溶解物を採取した。バイオセーフティーレベル３実験室から細胞溶解物を取り出し、沸騰させ、ポリアクリルアミドゲル上に負荷した。ライセートをドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、次いでポリフッ化ビニリデン膜に移した。次に、0.1％Tween-20（TBS-T）を含むトリス緩衝生理食塩水に溶解した5％脱脂乾燥乳で1時間、膜をブロッキングし、次いでTBS-Tで短い洗浄を行った。我々は、一次抗体、SARS-CoVスパイクタンパク質に対するウサギポリクローナル血清（#40150-T52; Sino Biological、https://www.sinobiological.comExternal リンク）、β-アクチン抗体（#4970; Cell Signaling Technology、https://www.cellsignal.comExternal リンク）、またはSARS-CoVヌクレオカプシドに対するカスタムウサギポリクローナル血清のいずれかで膜を一晩インキュベートした。その後、膜をＴＢＳ-Ｔで３回洗浄し、ワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体を１時間塗布した後、クラリティウエスタンＥＣＬ基質（＃１７０５０６０Ｓ；Ｂｉｏ-Ｒａｄ）でインキュベートし、多目的イメージングシステムでイメージングした。

SARS-CoVヌクレオカプシド抗体の生成

プラスミドpBM302(15)を用いて、C末端にHis6タグを持つSARS-CoVヌクレオカプシドタンパク質を大腸菌の包接体中で高発現させ、ニッケルアフィニティーカラムクロマトグラフィーを用いて包接体から組換えタンパク質を変性条件下で精製した。我々は、トリス／リン酸緩衝液に対するステップワイズ透析を用いて、尿素濃度を低下させながら、組換えSARS-CoVヌクレオカプシドタンパク質をリフォールディングし、タンパク質を再変性させた。次に、再変性した完全長のSARS-CoVヌクレオカプシドタンパク質でウサギを免疫し、アフィニティー精製されたウサギ抗SARS-CoVヌクレオカプシドタンパク質ポリクローナル抗体を生成した。

結果

2019年新規コロナウイルス疾患患者からの重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2によるサイトパシー効果のサムネイル、米国、2020年。A-C) 接種3日後のベロ細胞単分子膜の位相差顕微鏡。A）モック、B）鼻咽頭標本、C）咽頭標本。元の倍率は10倍）。) D) ウイルス単離株の電子顕微鏡写真。核カプシドを貫通する断面を持つ細胞外球状粒子（黒点）。矢印はコロ

図1. コロナウイルス疾患患者からの重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2による細胞毒性効果、米国、2020年。A-C) 接種3日後のベロ細胞単分子膜の位相差顕微鏡。A）モック、...

2020年1月22日にワシントン州でCOVID-19が確認された患者が同定された。モック感染細胞ではCPEは観察されなかった（図1、パネルA）。周期閾値（Ct）値はNP検体では18～20、OP検体では21～22であった（1）。陽性の臨床検体は、2020年1月22日にアリコートし、再凍結して細胞培養に接種した。接種後2日目にCPEを観察し、接種後3日目にウイルス溶解液を収穫した（図1、パネルB、C）。核酸抽出に50μLのパッセージ1ウイルスライセートを使用し、CDC分子診断アッセイ（1）を用いてSARS-CoV-2の存在を確認した。3つの核酸抽出物のCt値は、核酸カプシド部分1で16.0〜17.1、核酸カプシド部分2で15.9〜17.1、核酸カプシド部分3で16.2〜17.3であり、SARS-CoV-2の単離を確認した（Ct＜40は陽性と考えられる）。また、Fast Track 33アッセイを用いて、33種類の追加の呼吸器病原体について抽出物を試験した。他の病原体は検出されなかった。同一性は、さらに薄切片電子顕微鏡（図１、パネルＤ）によって支持された。我々は、コロナウイルスに特徴的な形態および形態形成を観察した。

全ゲノムシークエンシングにはOP検体とNP検体の1パス目から分離した分離株を用いた。NP検体（GenBank accession MT020880）とOP検体（GenBank accession No. MT020881）のゲノムは互いに100％の同一性を示した。また，対応する臨床検体（GenBank accession no.MN985325）とも100％同一性を示した．

第２継代以降は、OP検体とNP検体を別々に培養しなかった。ウイルス単離体をベロCCL-81細胞内でさらに2回パッセージし、50％組織培養感染量（TCID50）を決定して滴定した。3回目の継代では8.65×106 TCID50/mL、4回目の継代では7.65×106 TCID50/mLであった。

トリプシンの非存在下でこのウイルスをパサージュした。SARS-CoV-2のスパイク蛋白質配列は、S1-S2界面にRRARの挿入を有しており、これはfurinによって切断される可能性がある(16)。高病原性鳥インフルエンザウイルスは、ヘマグルチニンタンパク質HA1-HA2界面に高度に塩基性のフリン切断部位を有しており、これによりウイルスの細胞内成熟とより効率的なウイルス複製を可能にしている(17)。SARS-CoV-2のRRAR挿入は、同様の機能を果たす可能性がある。

続いて、別のアカゲザル胎児腎臓細胞株であるVeroE6細胞を用いて、SARS-CoV-2の第4継代ストックを作製した。SARS-CoV-2の第4継代ストックから得られたウイルスRNAの塩基配列を決定し、元の参照配列（GenBank accession no. MN985325）と比較して、ヌクレオチドの変異がないことを確認した。SARS-CoVはVeroE6細胞上で、MERS-CoVはVero CCL81細胞上で良好に増殖することが確認されている（18,19）。プラークアッセイを確立し、定量化のために好ましいVero細胞型を決定するために、我々は、VeroE6細胞およびVeroCCL81細胞上でパッセージ4ストックを力価化した。希釈系列での感染後、SARS-CoV-2は両Vero細胞型で複製したが、ウイルス力価はVeroCCL81細胞よりVeroE6細胞の方がわずかに高かった（図2、パネルA）。さらに、プラークは、Vero E6細胞でより明瞭で目に見えるものであった（図2、パネルB）。接種2日後の早い段階で、VeroE6細胞は、中性赤色で染色することにより、明瞭なプラークを形成していた。対照的に、ベロCCL81細胞では、はっきりとしたプラークの発現は少なく、接種３日後に中性赤色で染色することにより最も容易に定量化された。個々のプラーク単分子膜では、ベロE6細胞のSARS-CoV-2感染は、細胞クリアランス領域を有するCPEを産生した（図2、パネルC）。対照的に、Vero CCL81細胞では、プラークを形成するために融合した死細胞の領域があったが、細胞はクリアランスしなかった。これらの結果を合わせると、VeroE6細胞が増幅および定量化に最適な選択であるかもしれないが、両方のVero細胞型がSARS-CoV-2の増幅および複製をサポートしていることが示唆される。

いくつかの細胞型で SARS-CoV-2 の強固な感染が確認されたので、次に SARS-CoV-2 に対する SARS-CoV 抗体の交差反応性を評価した。感染した細胞株の細胞溶解物をタンパク質分析のためにプローブしたところ、SARS-CoVスパイクタンパク質およびヌクレオカプシドタンパク質に対するポリクローナル血清がSARS-CoV-2を認識することがわかった（図3、パネルB、C）。2B群ファミリー全体で高度に保存されているヌクレオカプシドタンパク質は、SARS-CoVとSARS-CoV-2の間で90％以上のアミノ酸同一性を保持している。複製結果（図3、パネルA）と一致して、SARS-CoV-2は、両方のVero細胞型において堅牢なヌクレオカプシドタンパク質を示し、HUH7.0および293T細胞においてはタンパク質が少なく、A549およびEFK3B細胞においてはタンパク質が最小であった（図3、パネルB）。SARS-CoVスパイク蛋白質抗体は、SARS-CoV-2スパイク蛋白質も認識し、交差反応性を示した（図3、パネルC）。SARS-CoVと一致して、SARS-CoV-2スパイクタンパク質のいくつかの切断形態および未切断形態が観察された。呼吸器細胞株であるCalu3細胞から得られたSARSスパイク陽性コントロールの開裂パターンはわずかに異なり、SARS-CoV-2のフリン開裂部位の挿入が予測されているため、2つのウイルス間のスパイクタンパク質のタンパク質分解開裂の違いを示している可能性があります（16）。しかし、細胞の種類と条件の違いは、この解釈を複雑にし、同等のシステムでのさらなる研究の必要性を示しています。全体的に、SARS-CoVヌクレオキャプシドおよびスパイクタンパク質抗体からのタンパク質発現データは、複製所見を再現しており、SARS-CoV試薬を使用してSARS-CoV-2感染を特徴付けることができることを示している。

最後に、SARS-CoV-2の複製速度を多段階増殖曲線で評価した。手短に言えば、我々はVero CCL-81およびHUH7.0細胞にSARS-CoV-2を低倍率（0.1）で感染させ、6時間ごとに細胞関連コンパートメントと上清コンパートメントで別々に収穫して、72時間の接種後にウイルスの複製を評価した（図4）。SARS-CoV と同様に、SARS-CoV-2 は初期の日食期を経て Vero 細胞内で急速に複製し、感染後 24 時間までに 105 TCID50/mL を達成し、106 TCID50/mL 以上でピークを迎えた。細胞関連コンパートメントと上清コンパートメントで同様の力価が観察されたが、これは効率的な退出を示唆するものであった。感染後48時間までにウイルス力価のピークを示したにもかかわらず，主要なCPEは60時間後まで観察されず，72時間後にピークを示した．HUH7.0細胞における複製もまた、最初の偏食期の後に急速に増加したが、細胞内コンパートメントでは2×103 TCID50/mLで24時間後の接種後までにプラトー化し、66時間後の接種後に減少した。感染したHUH7細胞の上清中には接種36時間後までウイルスは検出されず，すべての時点で低い力価を示した（図4）．HUH7.0細胞では主要なCPEは観察されませんでした。これらの結果は、SARS-CoVとMERS-CoVについての以前の報告と一致しており、人獣共通感染症のCoV株間で類似した複製動態が示唆されています（23,24）。

議論


ここに記載されている SARS-CoV-2 USA-WA1/2020 ウイルス株に関する情報を、Biodefense and Emerging Infections Research Resources Repository (https://www.beiresources.orgExternal Link) の試薬リソース（American Type Culture Collection, https://www.atcc.orgExternal Link）と、テキサス大学医学部ブランチの World Reference Center for Emerging Viruses and Arboviruses (https://www.utmb.edu/wrcevaExternal Link) に寄託し、米国の SARS-CoV-2 基準株としました。SARS-CoV-2第四通過ウイルスは、配列決定され、米国からの元の臨床株と同一のヌクレオチド配列を維持しています。これらの寄託により、このウイルス株は、基礎研究、診断開発、抗ウイルス検査、ワクチン開発のために、国内外の公衆衛生、学術、製薬の各分野で利用できるようになりました。このように広く公開されることで、対策の開発や試験の迅速化が図られ、この新しい新興ウイルスの感染性や病原性の理解が進むことを期待しています。


ハーコート博士は、米国疾病管理予防センター（Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA）の国立予防接種・呼吸器疾患センター（National Center for Immunization and Respiratory Diseases）の微生物学者である。彼女の研究テーマは、新興のコロナウイルスの複製と抗体応答です。

謝辞


SARS-CoVヌクレオカプシドタンパク質を発現するプラスミドpBM302を提供してくれたMavanur R. Sureshに感謝する。

記載された試薬は、国立衛生研究所アレルギー・感染症研究所のBiodefense and Emerging Infections Research Resources Repositoryから入手可能である。SARS関連コロナウイルス2、分離株USA-WA1/2020、NR-52281。

この研究は、国立老化研究所および国立衛生研究所アレルギー・感染症研究所の助成金（U19AI100625およびR00AG049092からV.D.M.、R24AI120942からS.C.W. およびAI99107およびAI114657からS.M.）、テキサス大学システムからV.D.M.に提供されたSTARs賞、テキサス大学メディカルブランチのヒト感染症・免疫研究所（S.M.）、およびテキサス大学メディカルブランチのMcLaughlinフェローシップ基金から提供された研修生の資金を提供しました。

参考文献
（略）

www.DeepL.com/Translator（無料版）で翻訳しました。




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最終更新：2020年10月17日 14:58

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