要旨
SARS-CoV-2 mRNA-LNPワクチンは、すでに何億回となくヒトに投与されている。しかし、このプラットフォームの免疫効果に関する包括的な理解は不足しています。mRNA-LNPベースのSARS-CoV-2ワクチンは炎症性が高く、その炎症誘導の原因となる合成イオン化可能脂質成分は生体内での半減期が長くなっています。慢性的な炎症は免疫力の枯渇や無反応につながるため、我々はmRNA-LNPへの事前曝露が適応免疫反応や自然免疫の体力に及ぼす影響を明らかにしようとした。その結果、mRNA-LNPまたはLNP単独での前曝露は、適応免疫応答の長期的な抑制を引き起こし、これは標準的なアジュバントを用いて克服できることがわかった。一方、mRNA-LNPsの前曝露後、インフルエンザウイルスの異種感染に対するマウスの抵抗性は増加し、Candida albicansは減少することが報告された。Candida albicansに対する抵抗力の低下は、血中好中球比率の全般的な低下と相関していた。興味深いことに、mRNA-LNPプラットフォームにあらかじめさらされたマウスは、獲得した免疫形質を子孫に引き継ぎ、インフルエンザに対する防御力を向上させることができる。要約すると、mRNA-LNPワクチンプラットフォームは、適応免疫反応と感染症に対する異種防御の両方に影響を与える予期せぬ免疫学的変化を長期にわたって誘発することがわかった。したがって、我々の研究は、このプラットフォームが人間の健康に与える真の影響を明らかにするために、さらなる研究の必要性を強調するものである。
キーワード：mRNA-LNP、ワクチン干渉、リプログラミング、遺伝
著者概要
我々は、mRNA-LNPまたはそのLNP成分への事前暴露が自然免疫および適応免疫応答に影響を与えるという実験的証拠をもたらした。mRNA-LNPsの前曝露は、適応免疫応答の長期的な抑制をもたらし、アジュバントの使用によってこれを克服することができた。一方、mRNA-LNPsの前曝露後、インフルエンザウイルスの異種感染に対するマウスの抵抗性は増加し、カンジダ・アルビカンスは減少したことを報告する。また、mRNA-LNPを曝露したマウスでは、一般的な好中球減少が検出された。興味深いことに、mRNA-LNPに事前曝露したマウスは、その子孫に獲得免疫形質を受け継ぐことができる。要約すると、mRNA-LNPワクチンプラットフォームは、適応免疫反応と感染症に対する異種防御の両方に影響を与えうる長期的な免疫学的変化を誘発し、その一部は子孫に遺伝する可能性があります。これらの効果のメカニズムを理解し、このプラットフォームが人間の健康に与える影響を判断するために、さらなる研究が必要である。
序論
mRNA-LNPワクチンプラットフォームは、現在進行中のSARS-CoV-2のパンデミックに伴い、大きな注目を集めました。当初、このワクチンプラットフォームは、自然免疫の活性化を抑えるためにmRNAが改変・精製されていることから、非炎症性であると考えられていました[1-3]。同時に、脂質ナノ粒子（LNP）成分は、mRNAの不活性キャリアおよびプロテクターであると考えられていた。しかし、最近、LNPの合成イオン化可能な脂質成分が非常に炎症性であり[4]、これが適応免疫応答の誘導をサポートする重要な成分であることが示されている。また、タンパク質と混合したLNPは、mRNA-LNPと同等の反応を誘導することが分かっています[5]。このプラットフォームは、様々な異なる炎症性サイトカイン、-経路、および自然免疫細胞の非存在下で、適応免疫応答の誘導をサポートすることができます[5-7]。
mRNA-LNPワクチンプラットフォームで報告されている急性副作用は多様であり、おそらくその高い炎症性性質と関連し、部分的に自然免疫反応によって媒介されています[4,8]。特異的なT細胞やB細胞の活性化の誘導に加えて、特定のワクチンや感染症は、自然免疫細胞の活性化を増加または減少させることにより、長期的な自然免疫反応に影響を与える可能性があります[9]。さらに、あるワクチンによって誘導された自然免疫の再プログラミングは、他のワクチ ンによって誘導された免疫応答を妨害する可能性がある[9]。抗原特異的な抗SARS-CoV-2応答の誘導以外のmRNA-LNPワクチンの短期および長期の免疫学的変化の可能性は、不明である。査読待ちの最近のヒトの研究では、このプラットフォームによる自然免疫と適応免疫の再プログラミングが報告されており[10]、一方、ワクチン接種者由来のヒト白血球のシングルセルRNA-seq研究でも、自然免疫細胞の著しい変化が明らかにされています[11]。報告された変化が長期にわたって持続し、免疫体力に影響を与えることができるか、あるいは他のワクチンによって誘導される応答を妨害することができるかどうかは、まだ解明されていない。
ここでは、mRNA-LNP動物ワクチン接種モデルを用いて、mRNA-LNPへの事前曝露が抗体応答を阻害することを示す。この阻害は、アジュバントを使用することで克服でき、タンパク質ワクチンの有効性を妨げることはなかった。しかし同時に、このワクチンプラットフォームは、インフルエンザ感染に対する自然免疫力を高めるが、カンジダ・アルビカンスに対する抵抗力を低下させることがわかった。インフルエンザに対する強化された免疫力は、子孫に受け継がれる可能性がある。
結果
LNPまたはmRNA-LNPへの前曝露は適応免疫応答を抑制する
前臨床動物試験で使用されたLNPは、非常に炎症性の高いものである[4]。LNPの重要な炎症性成分は合成イオン化可能脂質であり、ファイザー社のSARS-CoV-2ワクチンでは、in vivo半減期が20-30日と推定されている[12]。前臨床試験に使用されたLNPとファイザー社のワクチンは類似しており、Acuitas Therapeutics社によって製造されています[4-6]。慢性的な刺激を受けている免疫系は、しばしば疲弊し、無反応となることがあります[13]。mRNA-LNPプラットフォームは炎症性が高く、in vivoでの半減期が長いため、このプラットフォームへの事前曝露がその後の適応免疫反応に影響を与えるかどうかを検証しようとしたのです。私たちの研究室で開発された皮内免疫モデル[4,6]を用いて、これを検証した。成体WTマウスを、図1Aに示すように、PBS、eGFPをコードするmRNA-LNPs 2.5μg、または空のLNPs 2.5μgに皮内曝露した。2週間後、このマウスにPR8インフルエンザヘマグルチニン（HA）をコードする2.5μgのmRNA-LNPを同じ部位に注射した。
図1
mRNA-LNPまたはLNPへの事前曝露は、その後のmRNA-LNPワクチンによって誘導される適応免疫応答を有意に抑制する。
A). 実験モデル。動物を剃毛し、PBS、eGFPをコードするmRNA-LNP（eGFP）または空のLNP（eLNP）のいずれかを左上点に皮内接種した。2週間後、同じ部位にPR8 HA mRNA-LNP (HA)を注射した。2週間後に血清と皮膚排出リンパ節を採取し、ELISAを用いて抗HA血清抗体レベルを、フローサイトメーターを用いて胚中心（GC）B細胞応答を測定した（データの正規化の詳細については、材料と方法を参照されたい）。B). ELISAによって検出された血清抗HA抗体レベル。異なる血清希釈率におけるOD450の読み取り値（上）。各サンプルの相対曲線下面積（AUC）の総括グラフ（中央）。C). 同じマウスからのGC B細胞反応（CD38- GL7+）。各ドットは別々のマウスを表す。少なくとも2つの別々の実験からのデータをプールし、平均±SDとして示す。一元配置分散分析を用いて、有意性を確立した。**p<0.005, ***p<0.0005, ****p<0.0001.
接種後2週間、血清中の抗HA反応をELISAで測定し、皮膚排出リンパ節中のGC B細胞反応をフローサイトメトリーでモニターした（補足図1）のは、我々が以前に記載したとおりである[6]。我々は、無関係なタンパク質（eGFP）をコードするmRNAまたは空のLNPへの事前曝露が、抗体およびGC B細胞レベルの両方で、抗HA応答を有意に減少させることを見出した（図1BおよびandC）.C）.。mRNA-LNP群と空のLNP群との間には差がないことが分かった（図1BおよびandC）.C）。したがって、これらのデータは、このプラットフォームへの事前暴露がその後の適応免疫応答を阻害することができ、LNPがこれに重要な役割を果たすことを示唆している。
mRNA-LNPによる適応免疫応答の抑制は全身に及ぶが、注射部位でより顕著になる
ヒトはフォローアップ注射やブースター注射を同じ腕に同じような部位（三角筋）で受けることが多い。マウスでは、mRNA-LNPプラットフォームによる適応免疫応答は、主に注射部位を排出するリンパ節に搭載されます[6]。したがって、私たちは次に、観察された阻害が局所的なものか全身的なものかを見極めようとした。これを定義するために、上に詳述したのと同様の実験を行ったが、マウスの1つのグループは、最初の接種部位とは異なる領域で2回目の注射を受けた（図2A）。我々は、異なる場所に注射されたマウスは、PBS前処理と比較して、依然として抗HA反応の有意な減少を示すことを見出した（図2BおよびandC）.C）。しかし、その抑制は、同じ部位に注射したマウスよりも有意に少なかった（図2BおよびandC).C）。このように、LNPへの事前曝露は、全身的な形質を伴う注射部位優位性を示す。
図2
mRNA-LNPの前曝露は全身に影響を及ぼす。
A). 実験モデル。図1と同様であるが、グループの1つは一次曝露とは異なる場所に注入した。B). 血清抗HA抗体レベルに関するELISA OD450測定値および要約AUCグラフ。C). 同じマウスからの相対的なGC B細胞応答。各点は別々のマウスを表す。少なくとも2つの別々の実験からのデータをプールし、平均±SDとして示す。一元配置分散分析を用いて、有意性を確立した。*p<0.05, **p<0.01, ****p<0.0001.
mRNA-LNPの適応免疫応答抑制効果の持続時間
ヒトの健康という観点から、LNPへの曝露によって引き起こされる抑制効果の期間を定義することは、その影響を最小限に抑え、予防策を考案するために極めて重要である。抑制効果の持続時間を調べるため、WTマウスをPBSまたはmRNA-LNPに曝露し、2、4、8週間後に、上に示したようにインフルエンザHAをコードするmRNA-LNPを同じ部位に注射した（図3A）。接種後2週間では、前曝露4週間後に注入したマウスでも抗HA反応の有意な減少が見られた（図3BおよびandC）.C）。曝露後8週目でも、mRNA-LNP曝露マウスでは、GC B細胞応答は有意に低下したが、抗HA抗体レベルは低下しなかった（図3BおよびandC）.C）。このように、mRNA-LNPの前曝露による適応免疫応答の抑制は長く続くが、時間の経過とともに弱まる可能性が高い。
図3
mRNA-LNPへの事前曝露は、適応免疫反応に長期的な効果をもたらす。
A). 実験モデル。PBSまたはeGFP mRNA-LNPへの曝露後の示されたタイムポイントの動物に、PR8 HA mRNA-LNPを同じスポットに注射し、2週間後に描かれたように抗HA反応を評価した。B). 血清抗HA抗体レベルに関する要約AUCグラフ。C). 同じマウスからの相対的なGC B細胞応答。各点は別々のマウスを表す。少なくとも2つの別々の実験からのデータをプールし、平均±SDで示した。一元配置分散分析を用いて、有意性を確立した。*p<0.05, **p<0.01, ****p<0.0001.
アジュバントは、mRNA-LNPプラットフォームへの事前曝露によって誘導される抑制状態を克服するかもしれない
我々は、LNPへの事前暴露が、mRNA-LNPプラットフォームによって引き起こされる適応免疫応答を有意に抑制することを観察した。しかし、適応免疫反応の一般的な阻害があるかどうか、そしてmRNA-LNPへの事前暴露が他のワクチンによって引き起こされる適応免疫反応に影響を与え、免疫保護を変化させる可能性があるかどうかを明らかにすることは非常に重要である。我々はまず、mRNA-LNPの前曝露によって適応免疫応答が全般的に抑制されるかどうかを検証した。このために、抗ランゲリン抗体を用いてランゲリンを発現する樹状細胞（DC）に抗原を送達できる、我々の確立された定常抗原ターゲティングシステムを使用しました[14,15]。このシステムを用いたDCへの抗原送達は、活性化や炎症を誘発せず、定常状態でDCによって誘導される適応免疫応答の特徴付けに成功しました[14,15]。第一段階として、IAβ上に提示されたEαペプチドに特異的なCFSE標識した先天性CD4 T細胞をナイーブなWT B6マウスに養子移入した。翌日、このマウスにPBSまたはGFPをコードするmRNA-LNPを皮内投与した。曝露後14日目に、マウスにPBSまたは1μgの抗Langerin-Eαを静脈内注射した。4日後、マウスを犠牲にし、排出LNと非排出LNにおけるTEα細胞の膨張をフローサイトメトリーで評価した（図4A）。その結果、mRNA-LNPを予備投与し、Eα抗原を投与しなかったマウスのTEα細胞数は、PBS投与したマウスよりも少ないことが分かりました（図4B）。これに伴い、mRNA-LNP事前曝露マウスの排液・非排液LNの両方で、PBS投与マウスと比較してTEα細胞の拡大が著しく減少していることが確認された（図4B；排液・非排液LNのデータをプールしたもの）。このように、mRNA-LNPへの事前曝露は、おそらく前駆体数を減少させることによって、定常状態モデルで誘導されたT細胞応答を阻害する。この阻害がT細胞のレベルであるかどうかを判断するために、上記の実験を繰り返したが、TEα細胞はマウスをPBSまたはmRNA-LNPに曝露した13日後に移された。この設定では、移植されたT細胞は、DCなどの他の宿主細胞とは異なり、mRNA-LNPに曝露されておらず、前駆体数はグループ間で同程度になると予想される。移植1日後にマウスに抗Langerin-Eαを接種し、4日後のTEα細胞の膨張を測定した。この設定において、TEα細胞の正常な膨張を検出した（図4B）。したがって、これらのデータは、全体として、阻害がT細胞前駆体レベルであったことを示唆する。
図4
mRNA-LNPへの前曝露によって誘導される適応免疫応答の一般的な阻害は、アジュバントの使用によって克服することが可能である。
A). 実験モデル。CFSE標識TEα細胞を、PBSまたはeGFPをコードするmRNA-LNPへの曝露の1日前（D-1）または13日後（D13）に移植した。抗ランゲリン-EαペプチドをD14に静脈内投与した。マウスを犠牲にし、SDLNをフローサイトメトリーによるTEα細胞検査のために採取した。B). Eαペプチド刺激の有無によるTEα細胞応答の代表的フロープロット（上）、および生細胞中のTEα細胞の％および非免疫化対照に対する拡大TEα細胞の倍数変化に関する対応する要約グラフ（下）。C). 実験モデル。PBSまたはeGFP mRNA-LNPへの曝露の2週間後、動物はPR8 HA mRNA-LNP、またはミョウバンまたはAddaVaxと混合したHAタンパク質を同じ場所に注射された。抗HA反応は2週間後に描かれたように評価された。D). 血清抗HA抗体レベルに関する要約AUCグラフ。E). 同じマウスからの相対的なGC B細胞応答。各点は別々のマウスを表す。少なくとも2つの別々の実験からのデータをプールし、平均±SDで示した。Welchのt検定は、有意性を確立するために使用された。**p<0.005, ***p<0.0005, ****p<0.0001.
アジュバントがこの阻害を克服できるかどうかを調べるために、PBS、およびeGFPをコードするmRNA-LNP前曝露マウスに、インフルエンザPR8 HAをコードするmRNA-LNP、またはPR8 HAタンパク質とAlum（Th2アジュバント）またはAddaVax（Th1アジュバント）を混合したものを注射した（図4C）。mRNA-LNPへの事前曝露は、Alum-およびAddaVax-アジュバント化タンパク質によって誘導される適応的な抗HA応答を妨害しないことがわかった（図4DおよびandE）.E）.E）。したがって、これらのデータは、mRNA-LNPによる阻害が、アジュバントの使用により克服され得ることを示唆する。
mRNA-LNPへの前曝露は抗原レベルを低下させる
タンパク質ベースのアジュバントワクチンの有効性はmRNA-LNPへの事前暴露によって影響を受けなかったことから、mRNA-LNPプラットフォームによる阻害のメカニズムとして、mRNAの分解、翻訳などがあり、mRNAによってコードされる抗原の産生が制限される可能性があると推測されました。抗原の量が減少すると、適応免疫反応全体が低下する可能性があります。mRNA-LNPへの事前暴露が抗原産生の低下につながるかどうかを調べるため、PBS、ルシフェラーゼ（Luc）をコードするmRNA-LNPまたはPR8 HAに暴露した動物に2週間後にLuc mRNA-LNPを注射し、7日間毎日IVISを使って画像化した（補図2A）。LucまたはPR8 HA mRNA-LNPへの事前暴露は、PBSまたは無暴露のコントロールと比較して、シグナルを有意に減少させることが分かった（補足図2B-D）。したがって、これらのデータは、mRNA-LNPへの事前暴露が、mRNAの半減期や翻訳などを調節することにより、抗原レベルに影響を与える可能性があることを示唆している。
mRNA-LNPへの事前曝露後に産生される抗原のレベルが低いことをさらに証明するために、2回目の曝露として、eGFPをコードするDiI-ラベル化mRNA-LNPを使用した。この試薬により、mRNA-LNPを拾い上げ（DiI+）、mRNAをタンパク質に翻訳した細胞（GFP+）を検出することができた。接種2日後、mRNA-LNPに予めさらされたマウスの皮膚と皮膚排泄LNにおいて、DiI/GFP二重陽性細胞の割合が減少していることがわかった（補足図3）。全体として、これらのデータは、上に示されたルシフェラーゼシグナルの減少と一致し、mRNA-LNPへの事前曝露がその後のショットの効率に干渉するかもしれないことをさらに支持するものである。
mRNA-LNPへの事前曝露は、異種インフルエンザ感染に対する抵抗性を高めるが、カンジダ・アルビカンスに対する抵抗性は低下させる。
自然免疫細胞は、炎症シグナルに敏感に反応し、その後の自然免疫反応を促進または抑制するエピジェネティックな修飾で応答する[9]。その後、もしそのような効果がある種のワクチンによって誘発されれば、異種感染症に対する感受性に影響を与える可能性があります。mRNA-LNPへの事前曝露が異種感染症に対する感受性に影響するかどうかを評価するために、我々はマウスをPBSまたはeGFPをコードするmRNA-LNPに曝露した。2週間後、マウスに亜致死量のインフルエンザを経鼻接種するか、Candida albicansを静脈内接種した。病気の進行は、毎日マウスの体重を測定することで観察した（図5A）。その結果、mRNA-LNPを事前に投与したマウスは、PBSを投与したマウスと比較して、インフルエンザ感染に対する抵抗性が有意に高く、体重の減少も少なかった(図5B)。また、接種後7日目のmRNA-LNP前曝露マウスの肺では、ウイルス量が有意に低いことが分かりました（図5C）。感染前と感染7日後の肺のフローサイトメトリー分析では、自然免疫細胞の構成に大きな変化は見られなかった（補足図4）。一方、mRNA-LNP曝露マウスは、Candida albicans感染に対する抵抗力が著しく低下していた。また、この播種性カンジダ症モデルマウスの標的臓器である腎臓では、約 log 高いCFU数が検出された（図5E）。したがって、これらのデータは、mRNA-LNPへの事前曝露が自然免疫の体力を変化させる可能性があることを示唆している。
図5
自然免疫の体力はmRNA-LNPへの事前暴露で変化する。
A). 実験モデル。PBSまたはeGFP mRNA-LNPへの曝露の2週間後に、動物を亜致死量のPR8 HAインフルエンザまたはCandida albicansに感染させた。体重およびその他の属性は、描かれたようにモニターされた。B). PR8 HA influenza感染後の体重減少の割合と、それに対応するAUCの変化。C). 肺のウイルスコピー数。D). カンジダ感染後の体重減少率とそれに対応するAUCの変化。E). 腎臓のカンジダCFU数。F). PBSまたはmRNA-LNP曝露マウスのPBMCにおける好中球（gated on live cells/CD45+/Ly-6G+CD11b+）の代表フロープロット、およびサマリーバーグラフ。G). Candida albicans（CA）の殺傷率（candidacidal assay）。H). 好中球1個あたりのCA死滅数。各点は別々のマウスを表す。データは2-3回の独立した実験からプールしたものである。Welchのt検定は、有意性を確立するために使用された。*p<0.05, **p<0.005, ***p<0.0005, ****p<0.0001.
次に、mRNA-LNPへの前曝露がカンジダ菌のクリアランスに異常をもたらすメカニズムについて検討した。好中球は自然界における防御の第一線を担っており、真菌感染との戦いに重要な役割を担っている[16,17]。そこで、我々は、mRNA-LNPへの曝露が好中球の殺カンジダ特性を変化させるかもしれないと仮定した。これを検証するために、好中球の供給源として末梢血を用いた殺カンジダ性アッセイを設定しました[18-20]。アッセイ前の血液のフローサイトメトリー分析により、mRNA-LNP前曝露マウスでは予想外に好中球の割合が著しく低く（図5F）、それに伴ってB細胞が増加し、DCと単球には変化がなかった（補足図5）。好中球の割合の減少に伴い、mRNA-LNP曝露動物のPBMCを用いた培養から、より多くのカンジダCFUを回収しました（図5G）。しかし、細胞あたりで正規化した殺カンジダ活性は、群間で統計的な差を示さなかった（図5H）。したがって、これらのデータは、mRNA-LNPへの前曝露が白血球数に長期的に大きな影響を与え、好中球割合を減少させるが、その機能を妨げないかもしれないことを支持するものである。全体として、ここで報告された好中球減少症は、Candida感染に対するin vivo抵抗性の低下を説明するかもしれない。
mRNA-LNPへの前曝露によって引き起こされる免疫変化は遺伝する可能性がある。
脊椎動物において、免疫形質の次世代への伝達が最近報告されている[21-23]。ヒトでは、父親がBCGを接種した乳児では総死亡率が低いことが報告されており [24]、母親のSARS-CoV-2感染は、新生児におけるサイトカイン機能性の上昇と非特異的免疫インプリンティングと関連している [25]。最後に、訓練された免疫は、B型肝炎ウイルスに感染した母親の新生児に伝達されることが示されている[26]。mRNA-LNPプラットフォームは炎症性が高く、それに事前に触れることでインフルエンザへの異種感染に対する抵抗力が高まることが確認されたため、これらの形質の一部が子孫に遺伝するのではないかという仮説を立てました。この仮説を検証するために、我々は以前に述べたように、成熟したWT B6雌雄マウスに、インフルエンザPR8 HAをコードするmRNA-LNPを10μg皮内接種した[6]。免疫後2週間、マウスを抗HA ELISAによって免疫の成功をスクリーニングし（補足図6A-B）、次に以下のように交配した（図6A）：免疫した雄と免疫していない（DI；お父さん免疫）または免疫した雌（DMI；お父さんお母さん免疫）、および免疫した雌と免疫していない雄（MI；お母さん免疫）。非免疫雌と交配した非免疫雄を対照とした（DMN；父-母非免疫）。8〜10週齢の第1、第2、第4産仔の子孫に亜致死量のPR8インフルエンザを経皮的に接種し、14日間体重をモニターした（図6A）。その結果、DI群の1産駒のマウスは、ナイーブな親に由来する産駒と比較して、インフルエンザ感染に対する抵抗性が有意に高く、体重減少も少なかった（図6B）。MI群またはDMI群のマウスは体重減少から完全に保護された（図6B）。これは、母親の抗HA抗体によって提供される受動免疫によって大きく媒介されていると思われる（補足図6C）。DI群に由来する第2産仔は、非免疫の親の産仔ともはや差がなかった（図6B）。MIからの産子は、保護能の著しい低下を示したが、依然としてDMNの親からの産子より上であった（図6B）。興味深いことに、DMIからの産仔は、依然として体重減少からの完全な保護を示した（図6B）。第4の産仔で、DIおよびDMNマウスは類似したままであり、一方、MIおよびDMIマウスは、DMN産仔と比較して類似しているが、依然として有意に保護されていた（図6B）。したがって、これらのデータはすべて、親でmRNA-LNPワクチンによって誘発された免疫変化が子孫に受け継がれ、雄マウスと雌マウスの両方がこの伝達において重要な役割を果たすことを裏付けるものである。
図6
mRNA-LNPプラットフォームによって誘導された免疫変化は、遺伝する可能性がある。
A). 実験モデル。成熟したWT B6雌雄マウスに、インフルエンザPR8 HAをコードするmRNA-LNPを10μg皮内免疫した。免疫後2週間後にマウスを交配させた。非免疫雌と交配した非免疫雄をコントロールとした（DMN; dad-mom non-immunized）．免疫した雄と免疫していない雌（DI；お父さん免疫）または免疫した雌（DMI；お父さんお母さん免疫）、免疫した雌と免疫していない雄（MI；お母さん免疫）。8〜10週齢の第1、第2、第4産仔の子供に亜致死量のPR8インフルエンザを経皮的に接種し、14日間体重をモニターした。B). インフルエンザ感染後の体重減少率（上）、およびそれに対応するAUCの変化（下）。データは3回の交配による産仔を用いた1回の実験によるものである。インフルエンザチャレンジに使用した第1産仔のマウスの数（雌／雄）は、6／7（DMN）、8／6（DI）、3／9（MI）および8／7（DMI）；第2産仔について1／3（DMN）、6／9（DI）、7／5（MI）および6／2（DMI）；第4産仔については2／9（DMN）、8／13（DI）、9／7（MI）および7／8（DMI）であった。一元配置分散分析（One Way ANOVA）を用いて、有意性を確認した。***p<0.0005, ****p<0.0001.
ディスカッション
新しい抗COVID-19 mRNAワクチンの免疫学的効果は、SARS-CoV-2感染に対する一定の防御を誘導する以上のことは、ほとんど理解されていない。これらのワクチンに使用されているLNPプラットフォームの炎症促進特性を示した我々の先行研究に基づき、我々は、mRNA-LNPプラットフォームへの事前曝露が自然免疫反応と適応免疫反応の両方に長期的影響を与え、これらの形質のいくつかは子孫にさえ継承されることを報告した。
本研究の第一の目的は、mRNA-LNPへの事前の曝露が二次ワクチン接種の反応に影響を与えるかどうかを評価することであった。興味深いことに、我々は、mRNA-LNPを先に投与すると、実際に抗体反応が阻害されることを見いだした。この適応免疫応答の抑制は比較的長く続き、少なくとも4週間は効果が見られたが、8週間後には弱まり始めた。ヒトは、mRNA-LNPワクチンを3～4週間の間隔で2回投与する標準レジメン [27] を受け、異なる時点でブースター注射を受けます。我々のデータは、mRNAワクチンの2回目の接種を3週間から3ヶ月に遅らせると、抗体反応が著しく改善されることを示した最近の研究によって強く支持されています[28-30]。実際、以前の研究では、炎症はワクチン接種に対する反応性の低さと関連しており[31]、LNPプラットフォームの急性炎症性副作用が、2回目投与時の抗体反応の誘導を否定的に妨げているという仮説を立てることは合理的である。ワクチン接種の間隔を長くし、免疫系が恒常性に戻る時間を与えることで、2回目のワクチン接種の効果が向上すると考えられる。このように、今回の知見は、現行のmRNAワクチンの投与スケジュールを改善する上で重要な示唆を与えています。しかし、これらの効果をより詳細に評価するためには、今後さらに研究を重ねる必要があります。
複数回の前投与が適応免疫反応のさらに劇的な抑制につながるのか、またマウスとヒトのデータの間にどれほどの重複があるのかは、まだ解明されていません。適応免疫反応の抑制は、2回目の注射が前曝射の部位に行われた場合に、より顕著であった。これは、mRNA-LNPプラットフォームによる適応免疫応答が、注射部位から排出されるリンパ節に搭載される一方、他の二次リンパ系器官はほとんど温存されるという、我々の最近のデータと一致している[6]。これらのデータは、mRNA-LNPによる適応免疫応答の抑制が、最初の注射部位から遠く離れた場所でフォローアップ注射を行えば、部分的に軽減される可能性を示唆しています。
抑制のメカニズムとしては、mRNAの分解、翻訳などが考えられ、mRNAによってコードされる抗原の産生が制限される可能性があります。抗原の量が減少すると、適応免疫反応全体が低下する可能性があります。我々の予備的データは、この仮説を支持しています。我々は2つの独立したシステムを用いて、mRNA-LNPに事前暴露されたマウスでは、mRNA-LNPプラットフォームで抗原レベルが低くなると思われることを発見した（補足図2および3）。mRNA-LNPへの事前曝露が、mRNAの分解と翻訳の調節を通じてその後の適応免疫応答を実際に阻害することがさらなる研究で確認されれば、mRNAのヌクレオシド修飾段階はそれほど重要ではない可能性を示すことができる。ヌクレオシド修飾と二本鎖RNAの除去は、自然免疫の認識、活性化、IFNα分泌を低下させて副作用を減らし、mRNAの半減期を長くすることを目的としていた[1-3]。しかし、我々の予備的データは、LNPの成分が、おそらくその高い炎症性の性質によって、ヌクレオシド修飾とRNA精製の利点を少なくとも部分的に打ち消す可能性があることを裏付けている。我々は最近、mRNA-LNPに暴露された皮膚では、Toll様、RIG-1様、NOD-1様受容体シグナル伝達経路を含むいくつかの炎症性経路が非常にアップレギュレートされていることを報告した[4]。したがって、LNPとmRNA-LNPは、おそらく直接的または間接的に受容体に関与してインターフェロンを誘導し［4,7］、その後のmRNAの翻訳を低下させることができます。TLR4リガンドへの事前暴露は、mRNA-LNPからのRNA翻訳を有意に減少させました[32,33]。これらのデータを総合すると、mRNA-LNPプラットフォームの効率は、TLR/インターフェロン経路に関与するワクチンへの事前暴露や、自己免疫疾患や進行中の感染症などの既存の炎症環境に影響される可能性があることが示唆されます。
興味深いことに、定常状態の抗原標的化モデルを用いて、mRNA-LNPへの事前曝露がCD4 T細胞応答の抑制にもつながることを見いだしました。mRNA-LNPに曝露したマウスでは、CD4 T細胞の前駆体数が減少しており、これは増殖の低下と相関していた。ナイーブT細胞のI型インターフェロンや他のサイトカインによるアウトオブシーケンス（TCRとの結合前）刺激は、その抑制やアポトーシスにつながる可能性があります[34,35]。mRNA-LNPへの曝露が、同様のメカニズムを用いてCD4 T細胞の応答を制限するかどうかは、まだ調査中である。
我々のデータは、適応免疫応答の阻害が、Th1（AddaVax）およびTh2（Alum）アジュバントを含むアジュバントの使用により克服され得ることを支持している。これは、人間の健康という観点から非常に関連性の高い知見である。タンパク質/サブユニットワクチンへの干渉がないことは、mRNA-LNPプラットフォームへの事前暴露によってその有効性が妨げられないことを再確認させるものです。実際、mRNAワクチンをアデノウイルスベースの抗SARS-CoV-2ワクチンと組み合わせることで、血清反応と保護が実際に向上する可能性さえあることが示されている[36-38]。しかし、インフルエンザなどの弱毒生ウイルスワクチンの効果に影響があるかどうかは、まだ解明されていない。
私たちは、mRNA-LNPを事前に投与したマウスがインフルエンザに対する抵抗力を高め、それが肺のウイルス量の低下と相関していることを明らかにしました。なぜマウスがインフルエンザからよりよく保護されるのかは、まだ解明されていない。感染前と感染7日後のPBSとmRNA-LNP前処理マウスの肺の自然免疫細胞組成には、有意な変化は見られなかった。mRNA-LNPへの曝露がインフルエンザからの保護強化をもたらす可能性のある1つのメカニズムは、インターフェロンのような炎症性サイトカインによって制御されるRNA生物学にあるのかもしれない[34,39]。私たちが示したように、抗原レベルは2回目の注射で低くなった。したがって、特にインフルエンザはRNAウイルスであるため、同様のメカニズムでウイルスの複製が抑制されている可能性がある。インフルエンザとは対照的に、mRNA-LNPを投与したマウスは、播種したCandida albicans感染症のクリアランスに欠陥があった。カンジダを効率的に除去できないことは、血液中の好中球減少症と相関していた。mRNA-LNPにさらされた後の好中球数の変化が何によってもたらされたのかは、まだ解明されていない。このプラットフォームによって高度に誘導されるインターフェロン[7]は、保護を妨害する可能性があり[35]、また造血を阻害することが知られている[40-42]。造血の変化が好中球減少に寄与している可能性がある。重度の再生不良性貧血（造血幹細胞に影響を与え、好中球減少及び血小板減少を特徴とする）-、細胞減少-及び血小板減少の症例はすべて、ヒトにおけるこのプラットフォームで報告されている[43-49]。このワクチンによって引き起こされる免疫学的変化を2回目の注射の21日までモニターしたある小さなヒト研究（56人のボランティア）は、mRNA-LNPの2回目の注射後に白血球数が著しく変動したことを報告しました[11]。白血球数は、注射後1週間で正常化したようである。何がこのような白血球数の急激な変化をもたらしたのか、また、ワクチン接種後数カ月でさらに安定した変化が観察されるのかどうかは、まだ解明されていない。また、このプラットフォームを用いた自然および適応的な初期化に関する、まだ査読の終わっていないヒトの観察結果と、我々のデータの間にどの程度の重複があるのかも、まだ定義されていない[10]。私たちのデータがヒトに適用された場合、特定の感染症の発生率が変化することが予想されます。これと同様に、最近のレトロスペクティブな研究では、ワクチン接種者はワクチン接種後9ヶ月の間にワクチン未接種者よりも高い感染症リスクを示す可能性があることが判明しました[50]。免疫抑制状態の潜在的な兆候として、ウイルスの再活性化の報告 [51-55] や、開心術における感染症の疑いがあり、長期の抗生物質治療でも制御できず、数名の死亡につながった [56] がある。COVID-19に関連したカンジダ症，アスペルギルス症，ムコルミコシスの症例の急増が報告されている[57-59]．これらの症例のいずれかが、mRNA-LNPワクチンへの曝露に起因しうるかどうかは、まだ判断されていません。また、ヒトやマウスの免疫体力に対する複数回のmRNA-LNP注射の長期的な影響を確立するために、さらなる研究が必要であろう。
ヒトでは、mRNA-LNPワクチンを含む多くのワクチンは、使いやすさのために筋肉内投与される[60]。前臨床動物における皮内投与と筋肉内投与のワクチン研究では、同様の適応免疫反応の誘導が明らかになり、皮内投与の方がわずかに良好な反応を示しました[61,62]。mRNA-LNPプラットフォームによって誘導される炎症反応の性質と大きさは、送達経路に依存しない[4]。それらは、強固で一過性の好中球の流入、複数の異なる炎症経路の活性化、IL-1βやIL-6のような炎症性サイトカインの産生によって特徴付けられる。したがって、ここで観察された免疫再プログラムが皮内曝露に限定されるとは考えにくく、特にmRNA-LNPワクチン接種者のデータは我々の所見と一致しているため[10]。マウスとヒトの研究で使用されるワクチンの用量は大きく異なり、ヒトのワクチンの用量は体重に調整され、マウスの場合よりもはるかに低いです[63]。我々の研究では、マウスのワクチン研究で使用される量の下限を使用した [61]。我々の研究では広い用量範囲を行いませんでしたが、2.5μgの空のLNPと2.5μgのmRNA-LNP（2.5μgは、〜1：20または30の重量比でLNPと複合化したmRNAの量、すなわち〜50または75μgのLNP）に予備曝露すると、適応免疫反応が同様に抑制されることが確認されました。このように、用量は抑制の大きさと長さに関与しているかもしれないが、ヒトのデータと組み合わせた我々のデータは、LNPs/mRNA-LNpsが広い用量範囲で同様の効果を持つことを裏付けている。
非常に興味深い観察は、インフルエンザ感染に対してmRNA-LNPによって誘導された異種防御能の向上が、子孫にうまく受け継がれたことである。最近の多くの研究が、すべてではないが、マウスにおいて世代を超えて訓練された免疫または寛容のいずれかが伝達される証拠を報告している[23,64]。これらのデータが公表される前に開始され、実施された我々の独自の研究は、免疫形質の世代間継承の存在を裏付けているようである。mRNA-LNP プラットフォームの高い炎症特性が、遺伝した変化を誘発した可能性があり、mRNA ワクチン を接種したヒトでこのような免疫遺伝が観察されるかどうかを判断することは、非常に重要なことであると考 えられます。BCGを接種した両親の乳幼児が世代を超えて保護されることは、最近、疫学的調査で示唆されている[24]。自然免疫遺伝子におけるこれらの変化が、適応免疫反応にも直接的または間接的に影響を与えるかどうかは、まだ解明されていません。我々の実験プラットフォームは、オスの自然免疫の寄与を検出することができた。受動的に移行した母体抗体は、雌の自然免疫の寄与をほとんど覆い隠してしまった。しかし、DMI群の第2産仔はMI群の第2産仔より優れていることが観察された。これらのデータは、母体由来の抗体が存在する場合でも、父親から受け継いだ自然免疫形質が防御において本質的な優位性をもたらす可能性を示唆している。しかし、DI群の第2産駒はDMN群の産駒より優れていなかったが、DMI群の産駒はMI群の産駒より優れていたことから、これらのデータは、免疫担当の雌が、雄から受け継いだ免疫形質がもたらす利益をさらに後押しする可能性を示唆している。とはいえ、全体的な防御レベルは産駒が遅くなるにつれて軒並み低下しており、このような異種交配効果は動物の一生を通じて持続するわけではないことが示唆された。ここでは、子孫がインフルエンザに強くなるかどうかに注目したが、親が免疫後どれくらいの期間、獲得した免疫形質を受け継ぐことができるか、子孫の真菌感染に対する抵抗力が低下するか、自然免疫の変化が適応免疫応答を変えるかどうかを明らかにすることが重要であろう。また、遺伝のメカニズムもまだ解明されていない。おそらく、インターフェロンやその他の炎症性サイトカインが誘発したであろうDNAメチル化の変化が部分的に介在しているのだろう。DNAメチル化に基づく遺伝様式は、最近、異なる病原体への前曝露で観察される世代を超えた遺伝に関連して提案されている[64]。
結論として，COVID-19 に対する mRNA ワクチンに使用される mRNA-LNP プラットフォームの重要な免疫学的特性について説明することができた．これらの知見は、重要な生物学的および臨床的意味を持ちます。まず、我々のデータは、mRNA-LNPの投与が、少なくとも数週間、ワクチンの2回目の投与に対する体液性応答を阻害することを示しています。この発見は、mRNAワクチンの2回目の投与が、現在用いられているよりも遅いタイムポイントおよび異なる場所で投与されればより有効であり得ることを示唆しているので、人間の健康の観点から非常に関連しています。この結論は、実際にファイザー/バイオNTechワクチンの2回目の投与を遅らせることで、体液性および細胞性の反応が良くなることを示唆する最近のヒト研究によって、強く支持されています[28,29]。第二に、私たちの研究は、mRNA-LNPsプラットフォームによる真菌およびウイルス感染に対する変化した異種防御を示唆しています。第三に、我々の研究は、これらのワクチンが世代を超えて保護を伝達する能力を持つことも示しており、哺乳類におけるラマルク継承の概念を裏付けている[66]。しかし、我々の研究は、mRNA-LNPプラットフォームの様々な免疫学的効果を理解するための扉を部分的に開いているに過ぎません。この新しい技術に基づくワクチンに多くの人々が触れることを考えると、その全体的な免疫学的および生理学的効果を完全に理解するために、さらなる研究が必要である。このプラットフォームが人間の健康に与える短期的および長期的な影響を明らかにすることは、潜在的に有害な影響を減らすために最適化するのに役立つと考えられます。
素材と手法
倫理に関する声明
Thomas Jefferson UniversityのInstitutional Care and Use Committeeは、すべてのマウスプロトコルを承認した。プロトコル番号：02315
マウス
WT C57BL/6J および Balb/c マウスはジャックスから購入し、自家繁殖させた。Balb/cマウスはIVIS実験にのみ使用した。すべての実験は8-12週齢の雌雄マウスで行った。マウスはマイクロアイソレーターケージに収容し、オートクレーブで滅菌した餌を与えた。
mRNA-LNP
我々の研究では、米国特許US10,221,127に記載されているAcuitas Therapeuticsが所有するLNP製剤を使用しました。これらのLNPは、以前に慎重に特性評価され、ヌクレオシド修飾mRNAと組み合わせた前臨床ワクチン研究で広くテストされています[62,67]。以下の、以前に公開されたmRNA-LNP製剤を使用した。PR8 HA mRNA-LNP、Luc mRNA-LNP、eGFP mRNA-LNP-DiI、および空のLNPである。
感染症病原体
A/Puerto Rico/8/1934 influenzaの株はDr. Scott Hensley (University of Pennsylvania)から譲り受けた。本研究で用いた C. albicans 株は既報の通りである[68]．感染性物質を用いた作業は BSL2 実験室で行い、Institutional Biosafety Committee の承認を得た。
皮内投与による免疫
皮内免疫は、我々が以前に記載したように行った[4,6]。簡単に言うと、注射部位の毛をペルソナ剃刀で湿式剃毛した。次に、1st shotとして、20μlのPBSまたは同量のPBS中の2.5μg/spot mRNA-LNPsまたは空のLNPsをマウスの皮内（背中の左上部分）に注射した。2回目の2.5μg/spot mRNA-LNPs投与は、1回目の投与から2、4、8週間後に背中上部の同じ部位または反対側の部位に行った。プラットフォームの特異性を調べるため、5μgのHAタンパク質とAlum (InvivoGen) またはAddaVax (InvivoGen) を1:1 (v/v) の比で組み合わせ、1回目のmRNA-LNP注射の2週間後に同じ部位に皮下注射を行った。遺伝性免疫実験のために、親はPR8 HAをコードするmRNA-LNPを10μg (2.5 μg/spot; 4スポット)、または対応する量のPBSを注射された [4,6].
定常的な抗原ターゲティング
これらの実験は、若干の修正を加えて、以前に記載された[14,15]と同様に実施した。簡単に言えば、マウスは、mRNA（eGFP）-LNPまたはPBSへの皮内曝露の1日前または13日後に、CFSE標識した、先天的にマークした5×105 TEα細胞の静脈内（i.v.）移植を受けた。14日目に1μgの抗Langerin-EαまたはPBSをi.v.投与した。次に、マウスを4日後に犠牲にし、皮膚排出リンパ節（腋窩および上腕）を採取した。単細胞懸濁液を、固定生存率色素（Thermo Fisher）、CD4（GK1.5）、およびCD90.1（OX-7）で染色した。抗体はBioLegendから購入した。
リコンビナント・ヘマグルチニン(HA)タンパク質のラベル化
リコンビナントHAタンパク質（rHA）はNIHのBarney Graham博士とMasaru Kanekiyo博士からの親切な贈り物であった。Molecular Probes Alexa Fluor 647 Protein Labeling kit (A20173, Invitrogen)を用いて、製品のユーザーガイドに従ってrHAを標識した。
B細胞応答の特性評価
注射後14日目にマウスを犠牲にし、皮膚排泄リンパ節（腋窩と上腕）を採取した。セルストレーナーで機械的に破砕し、単細胞懸濁液を作製した。この細胞を、ダンプ（固定生存率色素、F4/80、CD11b）、CD38（90）、B220（RA3-6B2）、CD138（281-2）、GL-7（7）、スカ-1（D7）、IgD（11-26c.2a）、IgM（RMM-1）およびAF647-ラベル化rHAから成るB細胞パネルで染色した。GC B細胞集団を定義するために、以前に発表されたゲーティング戦略（補足図1）を使用した[6]。GC B細胞のパーセンテージは、実験間で正規化され、相対値として示される。正規化は以下のように行った。1つの実験から得られた全サンプルの平均GC %を使用して、各サンプルのGC %値（相対値）を割り出した。抗体はBD Biosciences、BiolegendまたはTonbo Biosciencesから購入した。染色したサンプルはFortessa（BD Biosciences社製）で処理し、得られたデータはFlowJo 10で解析した。
PR8 インフルエンザまたは Candida albicans による in vivo チャレンジ
これらの研究で使用されたインフルエンザまたはC.albicansの用量は、以前に記載されたものである[64,69,70]。ウイルス感染では、マウスをキシラジン/ケタミンの混合液で腹腔内注射して麻酔し、200 TCDI50 PR8 influenza virusを鼻腔内接種した。真菌チャレンジでは、マウスに3〜4×104CFUのC.albicansを静脈内注射した。その後、マウスは苦痛と体重減少について毎日観察された。体重減少のデータは、元の体重に対するパーセンテージで示した。
肺の免疫細胞の特性評価
マウスに2.5μg mRNA(GFP)-LNPまたはPBSを背中の左上部位に皮内注射した。2週間後、マウスに200 TCID50 PR8インフルエンザウイルスを経皮的に接種した。感染後7日目にマウスの肺を採取し、マウスを犠牲にして肺を摘出した。単細胞懸濁液は、我々が以前に記載したように調製した[71]。簡単に言えば、肺をミンチにして、Collagenase XI (Sigma-Aldrich)とDNase (Sigma-Aldrich)で消化し、セルストレーナーを通過させた。赤血球は ACK lysis buffer (Fisher Scientific) で溶解した．細胞をFixable viability dye (Thermo Fisher), CD45 (30 F11), Ly-6G (1A8), CD11b (M1/70), MHCII (M5/114.15.2), CD24 (M1/69), Ly-6C (HK1.4), CD64 (X54-5/7.1) および CD11c (N418)で染色した。
ウイルス負荷の定量化
マウスに2.5μg mRNA(GFP)-LNPまたはPBSを背中の左上部位に皮内注射した。2週間後、マウスに200 TCID50 PR8インフルエンザウイルスを経皮的に接種した。感染7日後にマウス肺を採取し、-80℃で保存する前に急速冷凍した。RNAは、E.Z.N.A. HP Total RNA Kit（Omega Bio-tek）を用いて、製造者の説明書に従って調製した。1μgのRNAを、iScript Reverse Transcription Supermix for RT-PCR (Bio Rad)を用いて、製造業者の説明書に従って逆転写させた。定量的PCRは、iTaq Universal SYBR Green Supermix (Bio Rad)を用いて、製造者の指示に従って行った。相対的ウイルス量は、マウスβ-アクチンを参照遺伝子として、PR8インフルエンザウイルス核タンパク質（NP）のΔCTにより測定した。Forward (5') Pr8 NP: CAGCCTAATCAGACCAAATG, Reverse (3'): TACCTGCTTCTCAGTTCAAG。Forward (5') β-Actin AGATTACTGCTCTGGCTCCTAGC, Reverse (3'): actcatcgtactcctgcttgct [72,73]。
真菌負荷の定量化
C.albicansチャレンジ後7日目にマウスを屠殺し、腎臓を摘出した。臓器はPBSでホモジナイズし、ホモジネートを希釈してYPAD寒天培地プレートに植え付けた。30℃で一晩培養した後、コロニーを手で数え、CFU/mlの臓器を算出した。
殺カンジダ作用試験
マウス背部左上に2.5 μg mRNA(eGFP)-LNP またはPBSを皮下注射した。2週間後、マウスを犠牲にし、PBMC単離と血清採取のために血液サンプルを採取した。PBMCを分離するために、まず血液を0.5M EDTAと9：1の割合で混合し、次に等量のPBSと混合した。次に、この混合物を4℃、300gで6分間遠心分離した。ペレットをACKに再懸濁し、5分間インキュベートした後、染色液で2回洗浄した。得られたペレットを300μlの染色用培地に再懸濁し、計数した。4×105cells/wellを96wellフラットボトムプレートに播種し，37℃，5 % CO2で1時間インキュベートした．C.albicans（CA）をマウス血清（最終濃度10%）でオプソニン化し、1.6×103 CAを含む100 μlをPBMCとともに/なしで各ウェルに添加した。2時間培養後、上清を回収し、ウェルをddH2Oで洗浄し、それらを合わせてYPAD寒天培地プレートのストリーキングに使用した[18-20]。30℃で一晩培養した後、CFUを読み取った。
血清の採取
血清の採取は、採血した血液を室温で30分間凝固させた後、4℃、13,500gで18分間遠心分離を行った。
白血球の特性評価
PBMCは以下の試薬と抗体で染色した：Fixable viability dye (Thermo Fisher), CD45 (30 F11), CD11b (M1/70), Ly-6G (1A8), CD64 (X54-5/7.1), CD11c (N418) およびMHCII (M5/114.15.2). 抗体はBioLegend, BD Biosciences, Tonbo Biosciencesのものを使用した。
ELISA法
Nunc Immuno 96ウェルプレート（Fisher Scientific）に、炭酸／重炭酸バッファー（Fisher Scientific）で希釈した1μg/ml（50μl/ウェル）のHAタンパク質（Sino Biological）を4℃で一晩または37℃で1時間塗布した。TBSで1時間洗浄・ブロッキングした後、血清サンプルを希釈し、プレートに加えた。連続的に希釈したHA特異的モノクローナル抗体 (Sino Biological) を標準とした。検出には抗マウスIgG-HRP (1:20,000; Fisher Scientific) とTMB (Fisher Scientific) 溶液を組み合わせて使用した。AccuSkan FC microplate photometer (Fisher Scientific) を用いて 450 nm の波長でシグナルを読み取った。
抗原量の解析
マウス背部左上に2.5ug mRNA(HA)-LNP またはPBSを皮内注射した。2週間後、同じ場所に2.5ug mRNA(eGFP)-LNP-DiIを注射した。注入後2日目にマウスを犠牲にし、皮膚と皮膚排出リンパ節（腋窩と上腕）を採取した。単細胞懸濁液を、我々が以前に記載したように、固定化生存率色素（Thermo Fisher）、抗CD45（30 F11）、CD11b（M1／70）、Ly-6G（1A8）、CD64（X54-5／7・1）、CD11c（N418）およびMHCII（M5／114・15・2）により染色した［71］。抗体は BioLegend, BD Biosciences, Tonbo Biosciences から購入した．
In vivo バイオルミネッセンスイメージング
イメージングには IVIS Lumina XR システム（Caliper Life Sciences社製）を用いた．B6マウス皮膚中のメラニンがルシフェラーゼ活性によって生成されるシグナルに干渉する可能性を抑えるため、これらの実験にはWT Balb/cマウスを使用した。PBS、ルシフェラーゼをコードするmRNA-LNPまたはPR8 HAを注射したマウスに、D-ルシフェリン（カリウム塩、Goldbio）を150 mg/kgの用量で腹腔内注射した。5分後、マウスは3 %のイソフルランを満たしたチャンバーで1分間麻酔された後、ガスポートを介して2 %のイソフルランを維持したイメージングプラットフォームに移された。キャリパー社製のLiving Image Softwareを用い、5秒間の露光時間におけるTotal Flux（photons/sec）を測定し、信号を取得した。総光束は、各画素の放射量（光子/秒/cm2/ステラジアン）を関心領域（ROI）の面積（cm2）×4πで合計または積分したものである。正確な定量性と比較可能性を確保するために、総フラックス値を正規化した。簡単に言うと、各独立した実験における正規化値（Vn）は、以下のように計算された。
Voは、与えられたタイムポイントにおける与えられたサンプルの元の総フラックス値であり、Vs¯¯¯は、すべてのグループのすべての値の平均値であった。
統計解析
すべてのデータはGraphPad Prism version 9.0.0で解析し、有意性を判断するために用いた統計手法は各図の下に記載した。
補足資料
PR8 HAインフルエンザ株についてはScott Hensley博士（UPenn）に、組み換えHAタンパク質についてはNIHのBarney Graham博士と金城勝博士に感謝したい。B.Z.I.はNIH R01AI146420, R01AI146101 および部局のスタートアップ資金によって支援されている。原稿を批判的に読み、編集してくれたTJUのTim Manser博士とRadboud大学のMihai Netea博士に感謝する。本書で報告された研究は、Jefferson HealthのSidney Kimmel Cancer Centerのフローサイトメトリーと実験動物施設を利用し、米国国立衛生研究所のNational Cancer Instituteから賞番号P30CA056036で支援されたものである。図はBioRenderで作成した。
脚注
利害関係の宣言
著者は、いかなる種類の競合も宣言しない。
参考文献
1. プソイドウリジンをmRNAに導入することにより、翻訳能と生物学的安定性が向上した優れた非免疫原性ベクターが得られる。Mol Ther. 2008. doi: 10.1038/mt.2008.200 [PMCフリーアーティクル] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].
（※mono....以下略、詳細は元サイトで）
（※mono....中座します。）
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