MONOSEPIA
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(※mono....ウイルス【SARS-CoV-2】の存在を前提にした論文。ワクチンのスパイク蛋白質には触れていないが、このページに掲載しておく。注ーーー速報ジャーナル誌BBR（Biochemical and Biophysical Research Communications）Cに掲載の記事、ということで。)


◆　SARS-CoV-2 spike S1 subunit protein-mediated increase of beta-secretase 1（BACE1）impairs human brain vessel cells
SARS-CoV-2スパイクS1サブユニットタンパク質を介したβセクレターゼ1（BACE1）の増加によるヒト脳血管細胞の障害について

ハイライト
  • SARS-CoV-2は内皮細胞を障害し、細胞の老化を誘導する。
  • SARS-CoV-2スパイクS1サブユニットタンパク質はBACE1発現を誘導する。
  • BACE1発現の増加は、血管の完全性障害と老化をもたらす。

概要
COVID-19感染者は，脳血管障害（CVD）や神経症状を含む心血管系疾患に罹患し続けており，その回復が不完全であることを示す証拠が増えつつある．最近の知見では，重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）感染によるダメージの一部，特に脳への影響は，スパイクタンパク質によって誘導され，初期の血液脳関門（BBB）の破壊につながる可能性があることが示されている．SARS-CoV-2感染細胞および動物では、年齢依存的な病原性が認められる。本研究では、SARS-CoV-2スパイクS1サブユニットタンパク質によって誘導されるBBB破壊と細胞老化の重要なメディエーターとして、内皮BACE1を同定した。ヒト脳微小血管内皮細胞（HBMVEC）においてBACE1が増加すると、ZO-1、オクルディン、クローディンなどのタイトジャンクションタンパク質のレベルが低下することが判明した。さらに、BACE1の過剰発現は、細胞の老化の典型的な特徴であるp16とp21の蓄積をもたらす。本研究の結果、SARS-CoV-2スパイクS1サブユニットタンパク質は、HBMVECにおいてBACE1の発現を上昇させ、内皮漏出を引き起こすことが明らかとなった。さらに、SARS-CoV-2スパイクS1サブユニットタンパク質は、p16およびp21の発現を誘導し、BACE1を介した細胞老化を示すことが、HBMVECのβ-Gal染色により確認された。以上、本研究により、BACE1を介した内皮細胞障害および老化がCOVID-19感染後のCVDと関連する可能性が示された。

　　キーワード
　　SARS-CoV-2COVID-19BACE1脳血管細胞老化

1. はじめに
重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2型（SARS-CoV-2）に感染した患者の多くは、初感染から回復した後も疲労感や認知障害、あるいは脳血管障害（CVD）を含む心血管疾患を発症することが最近の研究で明らかにされている（総称して long-COVID と呼ばれる）。一部の患者は感染後7ヶ月でもそのような症状を示し、long-COVIDに苦しみ続けます[1]。これは、スパイクのS1サブユニット、完全長スパイク、ヌクレオキャプシドを含むSARS-CoV-2抗原が持続的に残存していることと関連します[2]。最近の研究では、長いCOVIDによる認知障害は、20年に相当する加速度的な老化に相当することが実証されています[3,4]。SARS-CoV-2感染動物[5]やCOVID-19患者[6]では、加齢に伴う発症が観察されています。臨床研究によると、COVID-19患者の約30〜50％が長いCOVID症状を経験し、これは年齢や女性性が高くなるにつれて一般的である[7]。

SARS-CoV-2は、S1サブユニットを介して細胞に感染し、標的細胞上のACE2と結合する[8]。ACE2は肺、心臓、腎臓、脳、腸などの複数の臓器で発現しており、COVID-19患者の肺や脳を含む肺外の複数の臓器でウイルス要素が検出された[9]。COVID-19患者のいくつかの臓器からの組織学的データは、SARS-CoV-2が内皮細胞に直接感染する証拠を示している[10]。最近の研究では、SARS-CoV-2スパイクS1タンパク質が血液脳関門（BBB）を通過して脳実質に移行し、BBB障害を引き起こすことが示唆されている[11]が、BBB機能障害に関わるメカニズムは十分に検討されていない。

BACE1はアスパラギン酸プロテアーゼであり、細胞外ドメインに2つのアスパラギン酸残基の活性部位を持つ膜貫通型タンパク質である。また、βセクレターゼとして知られており、γセクレターゼと協力して、アルツハイマー病（AD）患者の脳に蓄積するアミロイド前駆体タンパク質（APP）を切断してアミロイドベータ（Aβ）を産生することが知られている。BACE1が脳血管内皮細胞のタイトジャンクションの完全性の喪失を誘導することを示す証拠が増えつつある[12]。脳アミロイド血管障害（CAA）の死後ヒト脳の微小血管では，BACE1の上昇が観察される[12]．内皮BACE1活性の異常は、内皮機能障害や記憶障害を誘発する[13]。したがって、内皮BACE1の発現増加は、タイトジャンクションタンパク質の喪失によるBBB崩壊と関連している可能性がある。

本研究では、SARS-CoV-2スパイクS1サブユニットタンパク質が、BACE1がupregulationしているヒト脳血管のタイトジャンクションタンパク質の完全性を崩壊させることを確認した。BACE1を阻害すると、SARS-CoV-2スパイクS1サブユニット蛋白質による内皮細胞の漏出が阻止された。さらに、SARS-CoV-2スパイクS1サブユニットタンパク質によるBACE1のアップレギュレーションは、細胞の老化に関連するβ-gal、p62、p21の蓄積を引き起こすことがわかった。これらの結果から、SARS-CoV-2スパイクS1サブユニットタンパク質による内皮BACE1が血管漏出と内皮老化を媒介し、脳血管の機能を低下させ、結果として脳卒中や出血などのCVDを引き起こす可能性があることが示された。

2. 材料と方法
2.1. 試薬
抗BACE1（CS-5606）抗体および老化β-ガラクトシダーゼ染色キット（CS-9860）はCell Signaling Technology（Beverly, MA, USA）から、抗p16（sc-1207）および抗p21（sc-756）抗体はSanta Cruz Biotechnology（サンタクルーズ、カリフォルニア、米国）から、抗occludin（ab31721）抗体はAbcam（ケンブリッジ、MA、米国）から、入手した。抗ZO-1（61-7300）、抗クラウディン-1（37-4900）、および抗クラウディン-5（35-2500）抗体は、Invitrogen（Carlsbad、CA、USA）より購入した。抗β-アクチン（A5316）抗体は、Sigma（Saint Louis，MO，USA）から入手した。SARS-CoV-2スパイクS1サブユニットタンパク質（10522-CV）は、R＆D Systems（Minneapolis、MN、USA）から購入した。β-セクレターゼ阻害剤IV（BI-IV；565788）および血管透過性アッセイキット（ECM644）は、EMD Millipore（Temecula、CA、USA）より購入した。

2.2. 細胞培養
ヒト脳微小血管内皮細胞（HBMVECs）は、Cell Systems社（Kirkland, WA, USA）から購入した。HBMVECは、20％FBS、3ng／mL組換えヒト線維芽細胞増殖因子-基本（FGF-b；ミリポア、テメキュラ、カリフォルニア、米国）、5U／mLヘパリン、ペニシリン（100U／mL）およびストレプトマイシン（100μg／mL）で補充したM199培地で培養された。ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVECs）はLonza（Walkersville, MD, USA）から購入した。HUVECは、完全なサプリメント（EGM-2 bullet kit, Lonza）を含む細胞増殖培地（EGM-2, Lonza）中で増殖させた。細胞は、37℃、5％CO2の加湿雰囲気下で維持した。

2.3. イムノブロット
プレートで培養した細胞をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄し、RIPAバッファーで溶解させた。細胞溶解液を遠心分離し（13,000rpm、30分、4℃）、ブラッドフォードタンパク質アッセイで製造元のプロトコルに従って濃度を測定した。タンパク質を4-12％NuPAGEゲル（Invitrogen）で分離し、ニトロセルロース膜に移した。膜は5%スキムミルクと0.1%Tween 20を含むトリス緩衝生理食塩水でブロックし、一次抗体とともに4℃で一晩インキュベートした。洗浄後、膜は二次抗体とインキュベートされた。タンパク質は化学発光キット (Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, UK, USA) で検出した。以下の一次抗体を用いた；抗ZO-1（1：1000）、抗p16（1：1000）、抗p21（1：1000）、抗occludin（1：1000）、抗claudin-5（1：1000）、抗claudin-1（1：1000）、抗BACE1（1：1000）および抗β-actin（1：5000）。

2.4. 2.4. 細胞へのトランスフェクション
pCMV-MycベクターにクローニングしたヒトBACE1で細胞を一過性にトランスフェクションした。トランスフェクションには、Lipofectamine LTX試薬とOpti-MEM培地（Life Technology, Grand Island, NY, USA）をメーカーの説明書に従って使用した。

2.5. 血管透過性アッセイ
血管透過性アッセイキットを、製品の説明書に従って透過性アッセイに使用した。簡単に説明すると、HBMVECを24トランスウェルプレートの1μm孔サイズのメンブレンインサート上に播種し、500μlの完全培地で満たした24トランスウェルプレートに移した。コンフルエント（100%）になった時点で、HBMVECをSARS-CoV-2スパイクS1サブユニットタンパク質で24時間処理し、その後、高分子量のFITC-Dextranを含む完全培地を細胞に補充した。インサートの膜を越えて移動したFITC-Dextranを24トランスウェルプレートで20分間回収し、移動したFITC-Dextranを含む100μl容量の培地を清浄な96ウェルプレートに入れて485nmで蛍光測定した。

2.6. 老化関連β-ガラクトシダーゼアッセイ
老化したHBMVECは、製造者の説明書に従って、老化関連β-ガラクトシダーゼ（SA-β-gal）染色キット（Cell signaling）により検出された。簡単に説明すると、SARS-CoV-2スパイクS1サブユニットタンパク質とインキュベートしたHBMVECを0.2％グルタルアルデヒドで室温で15分間固定し、β-gal染色液中で37℃にて一晩インキュベートした。老化細胞は、標準的な光学顕微鏡（Olympus, Tokyo, Japan）下でのβ-gal溶液の青色染色によって同定された。陽性染色を定量化するため、標準偏差を得るために、各サンプルについて、いくつかの視野で100個以上の細胞を数えた[14,15]。

2.7. 免疫蛍光アッセイ
細胞はPBSで素早く洗浄し、直ちにPBS中4％パラホルムアルデヒドで37℃、15分間固定し、PBSで3回洗浄した。細胞は100%氷冷メタノールで室温で10分間透過処理した。細胞をPBSで再洗浄し、4％ウシ血清アルブミンで1時間ブロックし、一次抗体（抗ZO-1、1：200）と共に一晩インキュベートした。一晩インキュベートした後、蛍光剤結合二次抗体を45分間適用し、カバーガラスで密封した。染色は、蛍光顕微鏡（Zeiss, Jena, Germany）を用いて確認した。

2.8. 統計解析
結果は平均値±S.D.で表した。グループ間の有意差の解析には、Student's t-testを適用した。

3. 結果
3.1. SARS-CoV-2 スパイク S1 サブユニットタンパク質はヒト脳微小血管の制御を異にする
SARS-CoV-2 spike S1 subunit proteinを24時間暴露したHBMVECにおいて、BBB形成に必須の成分であるZO-1、オクルディン、クローディンの発現を評価し、脳血管の健全性に及ぼす影響について検討した。その結果、SARS-CoV-2スパイクS1サブユニットタンパク質は、HBMVECのZO-1、オクルディン、クラウディン-5の発現を低下させることがわかった（図1A）。免疫蛍光染色により、ZO-1陽性細胞はSARS-CoV-2スパイクS1サブユニットタンパク質の存在下で消失することが明らかになった（図1B）。さらに、SARS-CoV-2スパイクS1サブユニットタンパク質に24時間暴露すると、血管透過性が上昇した（図1C）ことから、ヒト脳微小血管の調節異常が示唆された。

※mono....まだまだ続くので後ほど全機械翻訳予定。DR. DOGGIE氏の一連のtweetを読んでいただいた方が分かり易いかも。

※参考記事
■　みんな一度は通る道？とりあえずBBRC。　「環境バイオテクノロジー研究室の講義ファイルと研究アーカイブス（2019年6月29日土曜日）」より















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最終更新：2022年11月17日 20:34

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