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動脈腫と心血管イベントにおけるマイクロプラスチックとナノプラスチック
著者 Raffaele Marfella, M.D., Ph.D. https://orcid.org/0000-0003-3960-9270, Francesco Prattichizzo, Ph.D., Celestino Sardu, M.D., Ph.D., Gianluca Fulgenzi, Ph.D., Laura Graciotti, Ph.D., Tatiana Spadoni, Ph.D., Nunzia D'Onofrio, Ph.D., +35, and Giuseppe Paolisso, M.D. 著者情報および所属機関
2024年3月6日発行
N Engl J Med 2024;390:900-910
DOI: 10.1056/NEJMoa2309822
VOL. 390 NO. 10
要旨
背景
マイクロプラスチックやナノプラスチック（MNP）は、前臨床試験において心血管疾患の潜在的な危険因子として浮上している。このリスクがヒトにも及ぶという直接的な証拠は不足している。
方法
無症候性頸動脈疾患に対して頸動脈内膜剥離術を受けた患者を対象とした多施設共同前向き観察研究を行った。摘出された頸動脈プラーク検体は、熱分解ガスクロマトグラフィー質量分析法、安定同位体分析法、電子顕微鏡法を用いてMNPの存在について分析された。炎症性バイオマーカーは酵素結合免疫吸着測定法および免疫組織化学的測定法で評価した。主要エンドポイントは、プラーク中にMNPが認められた患者における心筋梗塞、脳卒中、または何らかの原因による死亡の複合とし、MNPが認められなかったプラークを有する患者と比較した。
結果
合計304例の患者が登録され、257例が33.7±6.9ヵ月の平均（±SD）追跡を完了した。150人の患者（58.4％）の頸動脈プラークからポリエチレンが検出され、その平均レベルはプラーク1mg当たり21.7±24.5μgであった；31人の患者（12.1％）にも測定可能な量のポリ塩化ビニルが検出され、その平均レベルはプラーク1mg当たり5.2±2.4μgであった。電子顕微鏡検査では、プラークのマクロファージ中に、目に見えるギザギザのエッジをもった異物が存在し、外部破片中に散在していることが明らかになった。X線検査では、これらの粒子の一部に塩素が含まれていることが示された。アテローム内にMNPが検出された患者では、これらの物質が検出されなかった患者よりも一次エンドポイントイベントのリスクが高かった（ハザード比、4.53；95％信頼区間、2.00〜10.27；P<0.001）。
結論
この研究では、MNPが検出された頸動脈プラークを有する患者は、MNPが検出されなかった患者に比べて、追跡34ヵ月後の心筋梗塞、脳卒中、または何らかの原因による死亡の複合リスクが高かった。(Programmi di Ricerca Scientifica di Rilevante Interesse Nazionale他からの資金提供。ClinicalTrials.gov番号、NCT05900947）。
プラスチックは、海流、大気風、陸上現象によって環境を汚染し、広く分布する一因となっている2,3。一旦自然界に放出されると、プラスチックは分解されやすく、マイクロプラスチック（5mm以下の粒子と定義）とナノプラスチック（1000ナノメートル以下の粒子）の形成につながる。どちらのタイプの粒子も、さまざまな毒性学的影響を引き起こす4,5。
マイクロプラスチックとナノプラスチック（MNPs）は、摂取、吸入、皮膚曝露を通じて人体に入り、組織や臓器と相互作用することが、いくつかの研究で示されている。in vitroの研究から得られたデータは、特定のMNPが内皮細胞やその他の血管細胞において酸化ストレス、炎症、アポトーシスを促進することを示唆している。動物モデルでは、心拍数の変化、心機能障害、心筋線維症、内皮機能障害におけるMNPの役割が支持されている13。しかし、これらの知見の臨床的関連性は不明である。ヒトにおいてMNPが血管病変に浸潤していることを示す証拠や、MNPの負荷と心血管疾患との関連を支持する証拠は不足している。
MNPがアテローム性動脈硬化プラーク内で検出可能であるかどうか、またMNPの負荷が心血管疾患と関連しているかどうかを調べるために、われわれは外科的に摘出した頸動脈プラーク中のMNPの存在を、熱分解ガスクロマトグラフィー質量分析法、安定同位体分析法、および電子顕微鏡法によって評価した。次に、MNPの存在が心筋梗塞、脳卒中、または何らかの原因による死亡の複合エンドポイントと関連しているかどうかを検討した。
方法
研究デザイン
多施設共同前向き観察研究を実施し、登録後に患者をグループ（MNPが検出されたプラークを有するグループとMNPが検出されなかったプラークを有するグループ）に割り付けた。患者は、2019年8月1日から2020年7月31日まで、カルダレッリ病院、Ospedale del Mare、サレルノ大学から募集した。介入の適応となる無症候性頸動脈狭窄症（北米症候性頸動脈内膜剥離術試験14で分類された）の連続患者を本研究のスクリーニング対象とした。合計447人の連続した患者に参加を呼びかけ、312人がスクリーニングを受けることに同意した。無症候性疾患を有する患者が参加対象として選択されたのは、術後生存の可能性を最大化し、プラークの表現型における患者間のばらつきを最小化するためであった15,16。ベースライン臨床検査が実施され、人口統計学的データ、臨床データ、治療介入データを収集するために電子カルテが評価された。生化学的変数を分析するために、一晩絶食後、標準的な手順に従って血液サンプルを採取した。頸動脈内膜剥離術を受けた後，2023年7月1日まで，非致死的心筋梗塞，非致死的脳卒中，あらゆる原因による死亡の発生率をモニターするために患者を追跡した。フォローアップのための訪問は一般的な臨床診療に従って行われ、予定されていなかった。追跡期間中に来院のなかった参加者は追跡不能とみなされた。イベントの判定は、熱分解-ガスクロマトグラフ-質量分析の結果（したがって群分け）を知らない研究者が電子カルテをレビューすることによって行った。プロトコルは地元の倫理審査委員会（Università Vanvitelli Caserta）の承認を得た。参加者は文書によるインフォームド・コンセントを行い、データ報告についてはSTROBE（Strengthening the Reporting of Observational Studies in Epidemiology）ガイドラインのチェックリストを遵守した17。
粥腫切除術で頸動脈分岐部から外科的に切除された粥腫性プラークの標本はガラス管に採取され、その後の分析のために液体窒素で凍結、10％緩衝ホルマリンで固定、または2.5％電子顕微鏡グレードのグルタルアルデヒドで固定された。11種類のMNPの存在量は、熱分解ガスクロマトグラフィー質量分析法（MNPを組み合わせて測定し、マイクロプラスチックとナノプラスチックを区別しない定量的手法）で測定し、結果は電子顕微鏡と安定同位体分析を用いて裏付けた（NEJM.orgで本論文の全文とともに入手可能な補足的方法のセクションと補足的付録の図S1を参照）。サンプルは研究者が入手可能になった時点で分析され、研究者は結果データを知らなかった。すべての著者は、この原稿を出版することに同意した。
患者
患者は18～75歳で、無症候性頭蓋外高悪性度（＞70％）内頸動脈狭窄を有し、頸動脈内膜剥離術を受ける予定である場合に適格とされた。除外基準は心不全、弁膜症、悪性新生物、高血圧の二次的原因であった。退院前の術後に合併症があった患者、データが不完全であった患者、追跡中に消失した患者は解析から除外した。
エンドポイント
主要エンドポイントは、MNPを含むプラークを有する患者と含まないプラークを有する患者における非致死的心筋梗塞、非致死的脳卒中、または何らかの原因による死亡の複合とした。副次的エンドポイントは、MNPを認める患者と認めない患者における、組織バイオマーカーのインターロイキン-18、インターロイキン-1β、腫瘍壊死因子α（TNF-α）、インターロイキン-6、CD68、CD3、コラーゲンのレベルとした。
統計解析
サンプルサイズを測定するための過去のデータはなかった。そのため、最初の100人の患者を含む中間解析を行い、サンプルサイズを算出した。61人の患者がプラーク中にMNPを認め、そのような患者はMNPを認めない患者よりも一次エンドポイントイベントのリスクが2.1倍高いことが観察された。αを0.05、βを0.2、MNPを認めない群におけるベースラインのイベント発生率を100人年当たり9件、追跡期間を3年とし、データ解析に比例ハザードモデルを用いることを意図して、246例のサンプルサイズを算出した。20％の追跡不能を予想し、サンプルサイズを300人に調整した。
アテローム性動脈硬化プラークの分析後、患者はMNPsのエビデンスがある患者（2つの物質のうち少なくとも1つが検出可能なレベルである）とMNPsのエビデンスがない患者の2群に割り付けられた。変数の分布はShapiro-Wilk検定を用いて評価した。連続変数は、正規分布データに対してはt検定、正規分布でないデータに対してはMann-Whitney U検定、カテゴリー変数に対してはFisherの正確検定を用いて2群間で比較した。MNPの負荷とプラークマーカーとの関連を推定するために線形回帰分析を行った。Cox回帰分析を用いて、プラーク内のMNPの存在と複合主要エンドポイントの発生率との関連を検討し、年齢、性別、体格指数、総コレステロール、高比重リポ蛋白および低比重リポ蛋白コレステロール、トリグリセリド、クレアチニン、糖尿病、高血圧、心血管イベントの既往で調整した。両側P値が0.05未満を統計学的有意とした。すべての計算はSPSSソフトウェア、バージョン12を用いて行った。図はGraphPad Prism, version 9.1.2を用いて作成した。
結果
研究集団とプラスチック負荷
頸動脈内膜剥離術を受けた患者312人をスクリーニングした。スクリーニングを受けた患者のうち、8人は脳卒中または退院前に死亡し、47人はデータが不完全であったか、追跡中に失われた（図1A）。平均（±SD）33.7±6.9ヵ月の追跡を完了した257人の患者のうち、150人（58.4％）が切除された頸動脈プラーク中に検出可能な量のポリエチレンを有し、そのうち31人（12.1％）は頸動脈プラーク中に測定可能な量のポリ塩化ビニルも有していた。プラーク中にこれらのMNPが認められた患者のうち、ポリエチレンの平均レベルはプラーク1mg当たり21.7±24.5μgであり、ポリ塩化ビニルの平均レベルはプラーク1mg当たり5.2±2.4μgであった（図1B）。
図1
頸動脈プラーク中のMNP。
ベースライン時の患者の特徴を表1にまとめた。MNPを認めた患者は、摘出プラークにプラスティックを認めなかった患者に比べて、若く、男性が多く、高血圧が少なく、糖尿病、心血管系疾患、脂質異常症が多く、喫煙が多く、クレアチニン値が高かった。患者の居住地域や登録施設によるMNPの発生率に明らかな差はなかった（図S2）。患者の臨床的特徴、検出されたMNPの有病率およびレベルに関して、解析に組み入れた患者と除外した患者の間に実質的な差は認められなかった（表S1）。
表1
ベースラインにおける患者の特徴。
電子顕微鏡検査と安定同位体を用いた分析
熱分解-ガスクロマトグラフィー-質量分析で得られた結果を実証し、MNP粒子のサイズに関する予備的な情報を得るために、無作為に選んだ10人の患者から採取したポリエチレンとポリ塩化ビニルの両方が陽性であったプラークサンプルを透過型電子顕微鏡と走査型電子顕微鏡を用いて評価した。透過型電子顕微鏡で可視化すると、粥腫性プラークに存在する泡状マクロファージ内やプラークの非晶質中に、おそらく異物由来と思われるギザギザのエッジを持つ粒子が存在することが示された（図2Aおよび図S3A）。これらの粒子はほとんどすべて1μmより小さく、おそらくナノメートルサイズであった。
図2
電子顕微鏡による動脈硬化プラークの分析。
走査型電子顕微鏡で後方散乱電子線を用いて同じスライスを観察したところ、透過型電子顕微鏡で観察された粒子と大きさや形が似ている粒子からスペクトルX線マップを作成した（図2B）。これらのマップから、プラークサンプル中の炭素と酸素の存在量が減少し、塩素の存在量が増加している証拠が得られた（図S3B）。粒子内で検出可能な元素とバックグラウンドに存在する元素を比較するために、2つの同じ領域からX線スペクトルを取得し、塩素濃度が粒子内部でより高いことを確認した（図S3B）。さらなる対照として、粒子のない隣接する同じ2つの領域の塩素含有量も比較したところ、塩素のレベルは同程度であった（図S3C）。塩素が固体状態では非生物学的な性質を持つ可能性が高いことを考えると、これらの結果はポリ塩化ビニルの沈着物であることを裏付けているのかもしれない。このような粒子のもう一つの例を図S3Dに示す。検査した10人の患者のうち4人からのサンプルは、このパターンで検出可能な塩素レベルを有していた。
石油由来のプラスチックは人体組織よりもδ13C値（炭素13と炭素12の比）が低いため、無作為の患者プラークサンプル26個について安定同位体分析を行った18。この分析により、δ13Cの同位体値が高いグループと低いグループという2つの異なる患者クラスタが同定され、それぞれ炭素13と炭素12の比が高いことと低いことが示された。δ13Cの同位体値が低いのは、石油由来の物質は人体組織よりも同位体信号が低いため、MNPによる汚染の可能性がある。δ13Cの低い同位体値は、MNPの痕跡があるプラークでより顕著であった（図S4）。
プラークの表現型
以前のデータから、MNPは炎症経路を誘導することが示唆されたため13、4つの炎症マーカー-インターロイキン-18、インターロイキン-1β、インターロイキン-6、およびTNF-α-を酵素結合免疫吸着法を用いて測定した（図3Aから3D）。プラークサンプルのコラーゲン含量（図3E）、リンパ球およびマクロファージ浸潤の2つのマーカーであるCD3（図3F）およびCD68（図3G）のレベルは、それぞれ免疫組織化学的アッセイによって評価した。線形回帰分析により、ポリエチレンの存在量とこれらのマーカーの発現レベルとの間に相関関係があることが明らかになった（図S5）。ポリエチレンの単独またはポリ塩化ビニルとの組み合わせの有無によって層別化したこれらの解析結果を図S6に示す。
図3
プラークサンプル中の炎症マーカー。
心血管イベント
一次エンドポイントイベント（非致死的心筋梗塞、非致死的脳卒中、または何らかの原因による死亡）は、33.7±6.9ヵ月の時点で、MNPsの証拠を認めなかった群では107例中8例（7.5％）に（100患者年当たり2.2イベント）、MNPsの証拠を認めた群では150例中30例（20.0％）に（100患者年当たり6.1イベント）発生した。複合エンドポイントの各要素の発生率をTable S2に示す。プラーク中にMNPを認める患者は、MNPを認めない患者よりも一次エンドポイントイベントを発症するリスクが高かった（ハザード比、4.53；95％信頼区間[CI]、2.00～10.27；P<0.001）（図4）。未調整のハザード比は2.84（95％CI、1.50～5.40；P＝0.007）であった。MNPsのレベルを連続変数として解析したところ、主要エンドポイントとの関連が示された（表S4）。
図4
MNPの存在と心血管イベントとの関連。
考察
頸動脈内膜剥離術を受けた無症候性高悪性度（70％以上）の頸動脈狭窄患者において、頸動脈プラーク内にMNPの証拠を有する患者は、粥腫内にMNPの証拠を有さない患者よりも、心筋梗塞、脳卒中、または何らかの原因による死亡の複合の発生率が高かった。職業暴露研究から得られた観察データによると、ポリ塩化ビニルを含むプラスチック関連汚染に暴露された人の心血管疾患リスクは、一般集団に見られるリスクよりも高いことが示唆されている19-21。前臨床モデルから得られた機序データは、MNPと同様の大きさの吸入金ナノ粒子などの他のナノ粒子で指摘されているように、MNPで観察される心血管毒性作用の潜在的な背景として、MNPの循環系への直接的な移行と間接的な機序の両方を提唱している22。マウスとラットを用いた様々な研究では、吸入と摂取の両方後にMNPが広範囲に分布し、高血管臓器と心臓に一貫して蓄積することが示された23,24。粒子径は、MNPが複数の組織に到達する能力に影響する。世界保健機関（WHO）の声明によると、直径がそれぞれ150μmまたは10μmより大きいMNPは血液中に吸収されず、血管を貫通しない25。今回の知見は、マイクロプラスチックではなくナノプラスチックが動脈硬化部位に蓄積する可能性を示唆している。実際、今回の研究で検出された粒子の大部分は、腸や他の障壁で示唆された200nmの閾値以下であり、散乱した破片として細胞外腔で確認できた。これは、粒子径が小さくなるにつれてMNPの吸収と分布が増加するという考え方と一致している26。ヒトを対象とした研究から得られたデータによると、肝臓サンプルで最大30μm、胎盤サンプルで最大10μm、肺サンプルで最大88μm、母乳と尿で最大12～15μm、全血で700nm以上のMNPが検出されている。
定性的には、熱分解-ガスクロマトグラフィー-質量分析により、試験した11種類のMNPのうち、ポリエチレンとポリ塩化ビニルがマイクログラム量（プラーク1ミリグラムあたりμg）で頸動脈プラーク内で検出可能であることが示された。同じ技術を用いた以前の研究では、ポリエチレンは健康なボランティアから採取した全血サンプルの約25％から検出され、最大濃度は1mlあたり7.1μgであった12。他の研究では、ポリエチレンとポリ塩化ビニルが、ヒトの母乳と尿中に最も多く検出されるMNPであることが示唆されている10,11。ポリエチレン繊維は、ヒトの肺組織で組織1g当たり1粒子の濃度で観察されている8。ポリ塩化ビニルの存在も、肝硬変患者から得られた肝臓サンプルで一貫して示されており、組織1g当たり数粒子の範囲であった9。ポリエチレンナノプラスティックは、ゼブラフィッシュ胚の心血管系にさまざまな有害作用を引き起こし、心嚢液貯留の発生、血管新生の阻害、血栓促進状態を引き起こすことが報告されている27。しかし、ほとんどの前臨床研究では、本研究で観察された濃度よりも高濃度のMNPが評価されており、このことが前臨床研究で得られた知見をヒトに外挿することを困難にしている。
ポリエチレンとポリ塩化ビニルは、さまざまな形で、食品や化粧品の容器、水道管の製造など、幅広い用途に使用されている。MNPは、飲料水、広範な食品、化粧品、大気中で、空気力学的直径が2.5μm以下の吸入可能な微小粒子状物質（PM2.5）と結合し、風によって長距離輸送される形でも見つかっている。我々の研究は、頸動脈プラーク内のMNPの存在の根底にある可能性のあるプラスチックの発生源を探るために特別に計画されたものではない。患者の自宅の所在地と被験者募集施設の所在地に基づくデータの比較では、明らかな違いは認められなかった。同様に、評価した11種類のプラスチックのうち、ポリエチレンとポリ塩化ビニルのみが検出された理由も明らかにできなかった。ポリエチレンとポリ塩化ビニルがプラーク内に優先的に蓄積されるかどうか、またこの点で他の種類のMNPよりも病原性が高いかどうかを評価するためには、さらなる研究が必要である。
我々の結果は因果関係を証明するものではないことに注意することが重要である。プラーク内のMNPの存在と心血管疾患または死亡の複合転帰の発生率との間の関連は、患者のライフコースにおける未知の曝露や、より広くは患者の健康状態や行動など、他の残存する未測定の交絡変数への曝露によるリスクも含んでいる可能性がある。さらに、心血管疾患の新たな危険因子であるPM2.5やPM10への曝露レベルは考慮していない31。
本研究には限界がある。予防策を採用したにもかかわらず、検査室での汚染を完全に否定することはできない。プラーク検体の採取と分析に最新の手順を適用したとはいえ、コンタミネーションの残存リスクは存在するかもしれない。研究対象以外のプラスチックが一切存在しないクリーンルームを使用した今後の研究によって、われわれの観察結果が裏付けられるかもしれない。われわれは研究対象者の社会経済的データを入手していない。我々の知見は、頸動脈内膜剥離術を受けた無症候性患者集団に関連するものであり、一般集団を代表するものではない可能性がある。本研究に参加した患者の代表性を表S5に示す。25,33,34。従って、プラスチックへの曝露が増加していると推定される数十年の間に、心血管疾患の発生率が低下していることを考えると、心血管疾患を促進するMNPの推定される役割は、一般的な危険因子と比較した場合、限定的である可能性がある35。しかし、われわれの研究の結果では、頸動脈プラークからMNPが検出された患者は、追跡調査34ヵ月時点で心筋梗塞、脳卒中、または何らかの原因による死亡の複合エンドポイントのリスクが高いことが示された。
注釈
著者らから提供されたデータ共有声明は、NEJM.orgで本論文の全文とともに入手可能である。
Marfella博士へのProgrammi di Ricerca Scientifica di Rilevante Interesse Nazionale（国益の高い科学研究プログラム）からの助成金（2020LM8WNW）、IRCCS MultiMedicaへのイタリア保健省-Ricerca Correnteからの支援、およびRajagopalan博士への米国国立衛生研究所からの助成金（1R35ES031702およびR01ES017290）によるものである。
著者から提供された情報開示書は、NEJM.orgで本論文の全文とともに入手可能である。
補足資料
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