今回はエクソームが呼気に含まれているとことを査読済み論文ベースで紹介します。加えてレプリコンワクチンのリスクについても議論したいと思います。
mRNA型ワクチンの最大の問題点は、抗原のｍRNAを細胞に導入して細胞内で抗原タンパク質を合成していることです。細胞内で合成されたタンパク質は断片化されて短いペプチドになり、MHCクラス1分子によって抗原提示されます。
こう書くと難しく聞こえますが、生体にとってウイルスに感染することは大きな脅威です。そのため、細胞には、現在、どのようなタンパク質を生産しているのか、細胞の膜表面に、その時点で合成しているパーツを並べて、私はウイルス由来のタンパク質は生産していないので殺さないでね、と言うメッセージを免疫システムのパトロール隊に発しているわけです。
ウイルスが細胞に侵入するとウイルスの粒子を構成するタンパク質を大量に生産する作業が始まります。このような細胞は殺してしまわないと、ウイルス粒子が大量に生産されて次から次への細胞に感染していきます。ウイルス感染細胞を殺すはたらきをしている細胞がキラーT細胞です。ウイルスが感染した細胞がキラーT細胞に殺されないようにするためには、このような抗原提示をしなければ良く、ウイルスの中には抗原提示を阻害する機能を持つものがありますが、免疫システムというのは良くできていて、MHC分子を細胞の膜状に発現しなくなった細胞は、ナチュラルキラー細胞に、怪しい細胞として認識されて殺されます。
このように生体にはウイルス感染細胞を殺す巧妙な仕組みが備わっています。mRNA型ワクチンでは、従来型であろうとレプリコンワクチンであろうと細胞内でウイルス由来のタンパク質を産生させる点は同じです。従って、この方式は抗原（新型コロナではスパイクタンパク質）発現細胞が殺されてしまう現象が避けられず、ｍRNAが導入された細胞が免疫システムに殺されてしまうと言う、まさしく致命的な欠陥を有しています。
このような致命的欠陥を持つタイプのワクチンですが、この仕組みを成立させるためには免疫抑制、とりわけキラーT細胞の機能を抑制する仕組みが必要になります。このメカニズムについてはｍRNA発現細胞から放出されるエクソソームにある特殊なマイクロRNAが含まれており、それが制御性T細胞を活性化するという分子機構を私は提案しています。制御性T細胞を活性化するとIL10という物質が放出され、それが抗体のIgG4化を招くことは教科書的な知識です。
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抗原提示とキラーT細胞による細胞殺傷の模式図をあげておきます。図の説明をしておくと、左の図は細胞が抗原提示をしている様子を示したものです。右の図はキラーT細胞が活性化されて異物を抗原提示している細胞を攻撃しているところです。いずれもワインバーグの「がんの生物学」からの抜粋です。
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このような問題のあるmRNA型ワクチンは全世界的にモラトリアム（接種中止）を行うべきであると私は考えています。接種を全面的に中止して被害の把握を行うべきだと考えています。このようなリスクの高いmRNA型ワクチンを疑似ウイルス化してしまう可能性が想定されているのがレプリコンワクチンです。今回はレプリコンワクチンの伝播の経路に深く関係する呼気にエクソソームが含まれているかどうかについて査読済み論文ベースで、以下、検討します。
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2007年にエクソソームにRNAが含まれていることが明らかになり、ある細胞から別の細胞にエクソソームを介してｍRNAが移行することが示されました。エクソソームが血液、唾液、母乳に含まれていることは既に紹介しましたが、ここまでの情報からは、ｍRNAが個体間で伝播される可能性があるものの、いわゆる濃厚接触でないと伝播されないようにイメージされます。言い換えると、体液の交換がなければ個体間伝播はなさそうと考えられます。一方で、伝播の経路として、見逃すことができないのが呼気を介する経路です。
接種者から謎の物質が放出され、非接種者が健康被害を受ける現象が問題になっています。この現象をシェディングと呼ぶべきかどうかはさていおいて、このような現象が問題になっていることは多くの臨床医が指摘しています。この現象が発生する理論的な基盤を考えるためにも呼気にエクソソームが含まれているかどうかを文献的に調べることは重要だと思います。というのはｍRNA型のコロナワクチンを接種された方の体内ではいたるところで、毒性のあるスパイクタンパク質が産生されますので、それがエクソソームに含まれて呼気から放出されることが明らかになれば、シェディングと現在、呼ばれている現象がおきても不思議はないということになるからです。
レプリコンワクチンの個体間伝播に関してもエクソソームが呼気に含まれているかどうかは重要な要素とナルでしょう。というのは、エクソソームが呼気に含まれているとなると、濃厚接触でなくともエクソソームがｍRNAを別の個体に伝播する可能性が出てきます。これもあくまでも可能性があるということだけで確定的なことではないことを書いておきたいと思います。しかし、このmRNA型ワクチンやレプリコンワクチンは人類が初めて実用化するものであり、想定されるリスクについては慎重に考えておくことが必要です。特にレプリコンワクチンの厚労省での審査がスタートしている現在、取り返しの付かない事態を招かないためにも、このことは重要なことだと思います。
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なぜならば、従来型のmRNAワクチンであれば、エクソソームによって、ある人の呼気を介してある個人から別の個人にｍRNAが伝播されたとしても、そのｍRNAの量は限られており、また通常のｍRNAは細胞内寿命が短いため、その効果は一過性であり、それほど心配しなくてもよかったと思います。健康被害で問題にすべきは接種者から放出されるなぞの物質が何かを調べることと、体外に放出されるエクソソームに有害なスパイクタンパク質が含まれているかどうかを心配すれば良かったからです。つまり、これまではエクソソームによるｍRNAやマイクロRNAの個体間での伝播は、あまり大きな生物学的意義はなく、呼気によるエクソソームの伝播があろうとなかろうと、その量がエクソソームを受け取った個体側で、RNAが増えていくことはないという状況でした。
このような状況を一変させるのがレプリコンワクチンです。レプリコンワクチンは、アルファウイルス由来のRNA依存的RNA合成酵素の遺伝子と抗原遺伝子のｍRNAを両方含んでいます。移動しながら自分のコピーを生産していくことが可能なウイルスもどきとも言える存在です。ｍRNAがエクソソームに内包されて細胞間で伝播していく機構がなければ、接種量が少なくてすむ経済的なｍRNAワクチンと言うことだけで終わっていたはずです。mRNA型ワクチンには既に何度も述べてきたような致命的な欠陥があるため、それ自体を推進してはならないものです。これまでは接種をしたくない人は接種をしなければ、体内にスパイクタンパク質のｍRNAが大量に侵入してくる事態は起きなかったわけです。いわば接種しない自由が存在していたわけです。もしも呼気によって、これがウイルスのように人類集団において感染拡大していくとなると、その影響は計り知れないものになるでしょう。接種しないという自由が脅かされるのです。
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実際に調べてみた結果、以降で紹介する論文により呼気にエクソソームが含まれることを前提として考えていくことが必要になったと思います。実際に、レプリコンワクチンの接種者から非接種者へ呼気を介してレプリコンが伝播するということが現実のものになろうとしています。ここまでが、長い前置きでした。以降で、呼気にエクソソームが実際に含まれていることを査読済み論文ベースで紹介します。
呼気にエクソソームが含まれているということは、いわゆるシェディングの問題を考える上でも重要です。さらに、明治製菓ファルマなどが実用化しようとしているレプリコンワクチンのリスクを考える上でも極めて重要な要素です。シェディングの問題についてはきちんとした解析が行われず放置されています。ｍRNAワクチン接種者から放出される何かがあって、それによる健康被害が報告されている以上、この問題を科学的に究明していくことは重要です。
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呼気に何が含まれるかで健康状態をモニターしようという試みはかなり前から行われています。実際、東芝は10年くらい前に呼気分析装置なるものを開発しています。その装置の紹介ページを最初にあげておきます。この装置では中赤外レーザーを呼気に照射して呼気に含まれるガス成分を分析します。このページは日本政府のサイトですがその一部を貼り付けておきます。この装置で測定されるのはガス成分ですが、mRNAワクチンを接種された方が非接種者と比べて特殊な成分を放出しているかどうかについて、このような装置で分析してみるのも一つでしょう。この装置ではエクソソームについては測定できませんが、呼気に含まれているエクソソームを分析しようという試みはかなり行われていますので以下のスレッドで紹介します。
https://gov-online.go.jp/eng/publicity/book/hlj/html/201408/201408_10_jp.html
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結論を最初に書いておくと、エクソソームは呼気にも含まれており呼気のエクソソームや肺胞洗浄液のエクソソームを使用して癌の診断の試みなど、非侵襲的に診断するツールとしての活用が行われているというのが実態です。最初の論文は昨年発表された（オンライン版は2021年の8月公開）論文ですが、詳しい内容は読んでもらうとして、ポイントだけを書いておきます。これは要旨の一部を翻訳したものです。
「最近、エクソソームは、タンパク質、コレステロール、脂質、およびDNA、mRNA、およびノンコーディングRNAの量を宿主細胞から標的細胞または組織に効果的に送達することが実証されました。これらは、血液、尿、呼気凝縮液、気管支肺胞洗浄液(BALF)、腹水、および脳脊髄液で検出できます。」
この論文の図を一枚貼り付けておきます。気管支肺胞洗浄液はさまざまな疾患の診断マーカー候補分子を含んでいるというのがこの論文が示そうとしていることです。
https://ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC9292261/
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もう一つ論文を紹介していきます。こちらはNatureの公開版電子ジャーナルのScientific Reportに掲載のものです。呼気の凝縮液から構造を壊さないように注意しながら取り出してクライオ電子顕微鏡と高解像度透過型電子顕微鏡で観察したということです。クライオ電子顕微鏡では実際の形態を捉えることができます。透過型電子顕微鏡というのは従来型の電子顕微鏡ですが呼気に細胞から放出された粒子状のもの（エクソソームを含む）が含まれていることが視覚的にわかります。
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呼気に含まれるエクソソームがmRNAを含んでいるかどうかについては今後の解析を待つ必要がありますが、これまでに蓄積しているエクソソームに関する知見から考えると蛋白質はもとよりｍRNAやマイクロRNAを含んでいると考えることは妥当なことだと思います。
ということで今回の結論ですが、呼気にエクソソームが含まれていることは科学的事実です。今後呼気由来のエクソソームに、例えばスパイクタンパク質が含まれているのか、またスパイク遺伝子のｍRNAが含まれているかどうかについて、科学のメスを入れていくのは重要なことだと思います。それが接種者からのシェディングに関する疑問を解決することにつながっていくでしょう。
最も重要なことは、呼気からエクソソームが検出されていることから、濃厚接触以外の経路でも、レプリコンワクチンの人から人への伝播、特に非接触での伝播の可能性は否定できないということです。レプリコンワクチンの開発を進めている製薬企業には人から人への伝播を早急に否定することが求められています。いまさら、コロナのワクチン、それもmRNA型を世に出して何の意味があるかを開発企業の経営者の方たちはよく考えるべきです。世界各国で多くの犠牲者を生み出してしまったmRNA型ワクチンをこれから漫然と実用化していくことは反社会的行為であると批判されてもしかたがないと思います。史上最大の薬害に、企業のリソースを投入した上で健康被害を生み出す可能性が高いワクチンを上市することがどのような意味を持つかについて、よく考えてほしいと思います。
mRNA型ワクチンには致命的な欠陥があることは多くの識者が既に指摘しています。手遅れになってしまう前にレプリコンワクチンを含むmRNA型ワクチンの実用化は全面的に中止すべきです。
午前7:23 · 2023年7月9日
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https://twitter.com/molbio08/status/1655680286213181444
DNA混入事件の裏で重大なイベントが進んでいます。ｍRNA型ワクチンの製造プロセスに大きな疑問が出てきているにも関わらず、さらに危険と思われる製品が世に出ようとしています。DNA混入事件のような騒動が起きている裏ではたいてい密かに重要なイベントがおきているのが世の常です。DNA混入問題では、シュードウリジン化ｍRNAがmRNA合成に使用されたプラスミドDNAと強固なヘテロ二重鎖（DNAとRNAによる二重鎖をこのようによびます）を形成し、そのために本来ならば効率よくDNAを分解するはずのDNaseIが十分機能しなかった模様です。本来DNaseIが十分機能すれば、DNAが数塩基という細切れの状態まで分解されるはずが、機能的な遺伝子が残存している可能性が問題となっています。この件は、いずれ、フレッシュなサンプルを利害関係のない研究者が正しい方針で解析すれば決着はつくものと思います。
この騒ぎの裏で、最悪の場合、人類の運命を決しかねない重要なイベントがおきています。4月28日に明治製菓ファルマが、COVID19用の自己増幅型mRNAワクチンの承認申請を行いました。自己増幅型mRNAワクチンというのは、抗原遺伝子のｍRNAに加えてRNA依存的RNA合成酵素遺伝子のｍRNAを一緒に投与することによって、ｍRNAが導入された細胞内で抗原遺伝子のmRNAを自己複製させてコピー数を増やすというものです。この論文は自己増幅型mRNAワクチンのレビューです。
Self-amplifying RNA vaccines for infectious diseases | Gene Therapy (
http://nature.com)
Fig1の一番上が従来型のmRNAワクチンです。B）が自己増幅型mRNAワクチンです。このケースではRNA依存的RNA合成酵素の遺伝子と抗原遺伝子の二つのｍRNAが連結されておりmRNA全体が増幅されます。C）のものはRNA合成酵素の遺伝子と抗原遺伝子が二つのｍRNAにわかれていおりトランス増幅型ｍRNAと呼ばれます。緑で示されているものがRNA依存的RNA合成酵素、つまりmRNAを細胞内で増幅する酵素（複合体）です。
これだけを聞くと、単にmRNA型ワクチンの変形のように聞こえます。エクソソームというものの存在が全く知られていなければ、気にならないことですが、細胞内で大量に合成されたRNAはエクソソームに封入されて細胞外に放出されます。放出されたエクソソームは他の細胞と融合し、融合した細胞にｍRNAなどの内包物を放出します。この現象がおきることは広く知られるようになっています。実際には、エクソソームにはRNA依存的RNA合成酵素と抗原分子のｍRNAが含まれることとなるでしょう。エクソソームが細胞から細胞へと伝播し、伝播した先の細胞で自己複製するというのはウイルスそのものとほとんど同じです。さらに問題なのは、今回のパンデミック騒ぎでシェディングが大きな問題になっていますが、それに対する科学的アプローチは十分行われていません。最悪のケースでは皮下接種された自己増幅型mRNAワクチンがエクソソームに内包されて汗に含まれる、あるいは肺胞から呼気とともにエクソソームが放出されるという事態です。こうなると原理的に非接種者は絶滅してしまいます。非接種者のはずが、満員電車で、自己増幅型mRNAワクチンを含むエクソソームを他の人から伝播されてしまい。いつの間にか接種者になってしまっていた。こんな事態を否定できないものを実用化するのは大きな間違いです。mRNAワクチンの製造プロセスに大きな問題があることがわかりました。本来ならば、あらゆるRNA製剤のモラトリアムを行うべきです。一定の期間、製遺および研究開発プロジェクトを全てストップし、問題点を整理した上で再開すべきかどうか協議すべきです。当面、明治製菓ファルマの自己増幅型mRNAワクチンの承認申請プロセスは現段階でストップするのが本来の姿でしょう。自己増幅型であろうとなかろうと、免疫システムにとって異物であるウイルス由来タンパク質を体内の細胞に生産させることは同じです。ｍRNAワクチンというプラットフォームは原理的に破綻しています。全てのｍRNAワクチンの製造販売、研究開発の中止を求めます。この製品が製造されるのが例の福島の工場です。このまま進むと我が国はmRNAワクチンの実験場と化し、止めどもなく大きな健康被害が発生するでしょう。騒ぎの陰で何が進んでいるのか、油断せずに状況を見ることが大事です。いかにしてこの動きを止めていくのか正念場にきています。
以下に修正。
製遺（これは 製造 です）および研究開発プロジェクトを全てストップし、問題点を整理した上で再開すべきかどうか協議すべきです。
実は、この発信のまえに自己増幅型mRNAワクチンの臨床試験に参加している大学の関係者と電話で話しました。大学名は明かしませんが、参加している医師の間ではブレーキのないワクチンという議論がなされているとのこと。伝播複製がどこまで続くかわからないということです。この大学で臨床試験を行っている製品は明治製菓のものではないことを書き添えておきます。
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【総説】エクソソームとは？ 「富士フィルム（2017年12月）」より
本記事は、
Exosomeガイドブック（2017年11月 第1版発行, 2019年5月 第2版発行）において、金沢大学医学系免疫学 華山 力成 教授に執筆いただいたものです。
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近年、細胞外小胞（EV）の研究が加速的に進展している。5 年前には年間 200 報程度の論文数であったが、2016 年には 1000 報以上の論文が発表され、様々な生理機能や病態発症との関連が示唆されている。EV は大きく分けてエンドソーム由来のエクソソームと形質膜由来のマイクロベジクルなどに分類することができるが、現在最も精製に用いられている分画遠心法で両者を厳密に分離するのは困難であり、便宜的に 10,000 × g で沈降しない EV をsmall EV（主にエクソソーム）と呼んでいる1）。
エクソソームは様々な細胞が分泌する小型（直径 30 ～100nm 程度）の膜小胞で、殆どの体液（血液や尿、髄液など）や細胞培養液中に存在している。エクソソームは脂質二重膜で囲まれた膜小胞で、多胞性エンドソームと呼ばれる細胞内小胞の中で産生され、多胞性エンドソームが細胞膜と融合することにより細胞外へと放出される。エクソソームには、エンドソーム由来の蛋白質（ESCRTs や TSG101 など）や細胞内輸送に関与する蛋白質（Rab GTPase など）、細胞膜由来の蛋白質（CD63, CD81 など）をはじめ様々な分泌細胞由来の蛋白質や RNA が含まれているとともに、分泌細胞の細胞膜やエンドソーム膜由来の脂質（コレステロールやスフィンゴミエリンなど）が含まれている2）。
長年エクソソームは、不要な細胞内容物の放出に関与すると考えられていた。しかし近年では、生体内で脂質・蛋白質・RNA 等を運ぶ新たな細胞間情報伝達媒体として注目されており、その生理的または病態生理的機能の解明とともに、これらの機能を用いた臨床応用研究、特に診断や治療、バイオマーカーの開発が急速に展開されている。
現在、エクソソームの研究は、ほぼ全ての研究領域（免疫、神経、癌、内分泌、循環器など）に跨り進められている。例えば、免疫細胞由来のエクソソームには抗原ペプチド/ MHC 複合体や様々な抗原が含まれていることが示されており、免疫細胞間での抗原情報の交換や、免疫細胞の活性化・不活性化など様々な免疫応答を制御する可能性が示されている3）。神経系では、神経回路の制御に関連するとともに4）、様々な神経変性疾患の原因蛋白質がエクソソームによって細胞外へ放出され他細胞へと伝播される事が明らかとなり、病態の進展に深く関与する可能性が示されている5）。
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癌細胞が放出するエクソソームには、血管新生や免疫逃避に関連する分子が多数含まれており、癌細胞の成長に適した微小環境を構築し、癌の進展を促進するのに寄与していると考えられている6）。また、癌細胞由来エクソソーム上の接着分子の発現様式により、どの臓器へと癌が転移するかが決められていることが明らかになっている7）。
最近、脂肪細胞が放出するエクソソームは、肝臓での遺伝子発現を制御することが報告されている8）。また、多くのウイルスがエクソソームの産生経路を利用して産生される一方で、細胞に感染した細菌や寄生虫が、エクソソームを介して他細胞に感染している細菌・寄生虫の活動を制御する可能性が示されている9, 10）。
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これらの機能の殆どが、エクソソームに存在する分泌細胞由来の分子によって引き起こされる。中でも、エクソソーム内には分泌細胞由来の mRNA や miRNA が存在することが判明してからは、エクソソームが細胞間における遺伝子発現情報の水平伝播に関与する可能性が非常に注目されている11）。これらの RNA はエクソソームの脂質二重膜に守られている為、RNase により分解されず、血中や体液中で安定なまま存在している。
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標的細胞に取り込まれたエクソソームは、エンドソーム膜と融合することにより、中に抱え込んでいた RNA を標的細胞の細胞質へと放出する。放出された mRNA は蛋白質に翻訳される一方、miRNA は標的遺伝子の翻訳を抑制することで、エクソソームは標的細胞内での遺伝子発現を制御する。１つのエクソソームに含まれる蛋白質は数万種類、mRNA、miRNA は数千種類以上あると想定されているが、その構成は由来細胞ごとで異なるとともに、その細胞の状態によっても変化する。
また、エクソソームにおけるこれらの構成は、分泌細胞内での構成と異なっており、エクソソームに特異的な蛋白質や mRNA/miRNA が選択的にエクソソームへと積載される機構が存在すると考えられる。このような特異性から、エクソソーム内の RNA はバイオマーカーとして、更に治療開発の標的として注目されている。一方、エクソソーム中の mRNA は標的細胞に取り込まれるとその細胞内で機能性蛋白質の発現を引き起こしうるが、エクソソーム中の miRNA の多くが、機能性 miRNA ではなく前駆体であり、どのような生理的意義をもつかが研究されている。
このように、エクソソームには多種多様な蛋白質や RNA、脂質が含まれているため、細胞ごとに分類し、データベース化（ExoCarta）することが進められている。更に、プロテオミクスやトランスクリプトミクス、システムバイオロジーを駆使した大規模解析が世界各地で個別に行われているが、解析法の共通化を目指した解析ツールとして FunRich の EV plugin が公開されている。今後、エクソソーム研究を推進するにあたっては、様々な分野の研究者が情報を共有することが必須である。
エクソソームを用いた治療法や診断法の開発
エクソソームの機能が明らかになるにつれ、近年ではその機能を応用した治療法の開発が行われている。例えば、血中の線維細胞（間葉系前駆細胞の一種）から放出されたエクソソームは、角化細胞の遊走と増殖、血管新生を促進することで創傷治癒を促進する。この過程でエクソソーム内の血管新生促進性 miRNA や抗炎症性 miRNA、コラーゲン沈着促進性 miRNA などが関与すると報告されている12）。
また、癌患者の樹状細胞から放出されたエクソソームには、様々な癌細胞由来の蛋白質が含まれており、癌細胞特異的な細胞傷害性 T 細胞の強い活性化を引き起こす。この機構を用いた抗腫瘍免疫療法の開発が初期臨床研究の段階にある13）。一方、病態発症に関与するエクソソームの機能を抑制する試みもなされている。例えば、関節リウマチ患者の滑膜線維芽細胞から放出されるエクソソームには、細胞死を誘導する TNF-α が高濃度に集積しており、関節リウマチの病態を増悪させている14）。
また上述の通り、癌細胞由来エクソソームには癌進展関連分子、神経細胞由来エクソソームには神経変性疾患関連分子が含まれている為、これらのエクソソームを阻害または除去することにより、病態の発症を抑制できる可能性がある。今後の研究の発展により、エクソソームの機能解明と臨床応用への適応を拡大し、様々な疾患の治療にエクソソームを用いることが期待される。
さらに、エクソソームを用いて、siRNA や抗癌剤などの薬剤を目的の細胞に運ぶ試みがなされている。エクソソーム膜表面には様々な細胞接着分子が発現しており、その様式によってエクソソームがどの細胞へと運ばれるかが明らかになりつつある為、この特性を応用した新規 DDS の開発が期待されている15）。
エクソソームは体液中で非常に安定であるとともに、小胞内に含まれる蛋白質や RNA はエクソソームの脂質二重膜に守られており分解されない。また、採取後長期間保存された体液中においてもエクソソームは比較的安定である為、エクソソームは臨床検査における新たな疾患バイオマーカーとして有望視されている。
様々な疾患との相関が調べられているが、特に血中に放出された癌細胞由来エクソソームは、健常細胞由来エクソソームと構成分子の違いが注目されており、癌の早期診断のツールとして癌進展との相関関係が調べられている16）。更に、尿中のエクソソームは腎臓や前立腺、膀胱疾患の新たな診断マーカーとして、髄液中のエクソソームは脳内の腫瘍や神経変性疾患の新たなマーカーとして期待されている。
エクソソーム研究の課題と今後
エクソソームの役割について既に数多くの研究が報告されているが、これらの現象の根拠となる実験では、体液や培養細胞上清などから精製し高度に濃縮されたエクソソームが用いられており、このような現象が生体内で本当に起きているのかは未だに確かではない。エクソソームの生理作用を明らかにする唯一の方法は、エクソソームの放出機構を明らかにし、それを亢進または阻害することによって、どのような生理現象が引き起こされるのかを解明することであり、更なる研究の発展が期待される。更には、生体内におけるエクソソームの動態（どのエクソソームがどこへ行くのか）も今後の研究開発において取組むべき重要な課題である。
また、これまでエクソソームを精製する方法として、超遠心法や PEG 沈殿法を利用した各種市販キットが主に用いられてきたが、これらの方法では非常に多くの夾雑物が混入しており、実験結果が本当にエクソソームの構成分子による作用であるのかは慎重な解析を要する。更に、超遠心法は操作が煩雑である為、回収量が不安定で定量的な解析が行えない上に、高額な超遠心機を必要とし多検体の解析が行えないなどの問題点が存在する。このような状況では、エクソソームの研究を進めるのは困難であり、エクソソームを簡易に高純度で精製する技術の開発が早急に求められている。
そこで我々は、マクロファージに発現するエクソソームの受容体 Tim4 に着目し、Tim4 の細胞外領域と磁気ビーズを結合させた「Tim4 磁気ビーズ」を作製した17）。Tim4 はエクソソーム膜表面のリン脂質ホスファチジルセリンとカルシウムイオン依存的に結合することから、キレート剤である EDTA を含む溶出バッファーを用いることで遊離させ、高純度なエクソソームをインタクトな状態で精製することが可能である。
実際、Tim4 アフィニティー法を用いて、ヒト白血病細胞から放出されたエクソソームを精製し、その純度を超遠心法やPEG 沈殿法により精製したエクソソームと比較したところ、Tim4 アフィニティー法では他の方法に比べ 10 〜100 倍以上にエクソソーム特異的な蛋白質が強く検出されるとともに、エクソソーム以外の夾雑物がほとんど混入しておらず、高純度なエクソソームを再現性よく回収できることが明らかとなった。
その結果、これまで同定することができなかったエクソソーム上の蛋白質や RNA を数多く同定することが可能となった。更に、Tim4 のエクソソームへの強い結合能を応用し、エクソソームを ELISA や FACS で高感度に検出・定量することが可能となった。また、マイクロベジクルは従来、分画遠心法で粗精製することしかできなかったが、Tim4 アフィニティー法を用いることで高純度なマイクロベジクルの精製も可能になった。
本ガイドブックでは、これらの技術について詳細に解説しており、今後この技術の有用性が世界中で評価され、エクソソームやマイクロベジクル本来の生理機能の解明に大きく貢献することを期待している。
エクソソームの検出や単離の難しさ、更には種々の分類方法があるため、どのような方法により精製した細胞外小胞をエクソソームと呼ぶのかが研究者間で統一されておらず、実験データの解釈や再現性の確認を困難にしている。近年、国際細胞外小胞学会が設立され、世界的な研究者コミュニティーが形成されつつあり、国際基準の MISEV ガイドラインが提案されているので、新たに EV の研究を行おうと考えている研究者は是非一読頂きたい18, 19）。
また、このような混乱を回避する方法の１つとして、各論文における実験条件を記録する EV-TRACK knowledge databaseが設立されている20）。一方、EV 研究が世界的に注目されるにつれ、各国で大型研究プロジェクトが開始されている。既に米国では NIH による戦略的大型プロジェクト（Extracellular RNA Communication）が開始されており、Gordon Conference や Keystone Symposia といった国際的に権威のある会議においても 2016 年より分科会が発足している。
欧州の医薬品研究開発官民パートナーシップ「革新的医薬品イニシアチブ（IMI）」の支援を受け進められている CANCER-ID プロジェクトでは、EV を含めた研究が既に実施されている。日本においても、2017 年の文部科学省の研究開発戦略目標の１つとして EV 研究が選定され、今後研究の加速が期待されている。何れにせよ、今後の EV 研究の発展には、その基盤となる確固たる研究手法や技術の開発が必須であり、Tim4 アフィニティー法がその１つとなることに期待している。
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がん細胞の排出物が正常細胞をがん化させる！？ 「Nature ダイジェスト（原文：Nature (2014-10-23) ）」より
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腫瘍細胞から放出されたエキソソームと呼ばれる小胞が、正常な細胞をがん化させる可能性があることが分かった。
がん細胞が外に捨てた「ゴミ」が、周囲の正常細胞を腫瘍細胞に変えてしまっているかもしれない。
多くの細胞は、さまざまなタンパク質やDNA、RNAを含んだ「エキソソーム」と呼ばれる微細な膜小胞を外部に多数放出しており、がん細胞もその例に漏れない。この放出プロセスは、細胞の廃棄物管理システムの1つと考えられている一方で、細胞間コミュニケーションを手助けしている可能性もある。放出されたエキソソームの一部は、別の細胞と融合して、その細胞内に「荷下ろし」することがあるからだ。
テキサス大学MDアンダーソンがんセンター（米国ヒューストン）のがん研究者Raghu Kalluriのチームは今回、ヒト乳がん細胞由来のエキソソームにさらした正常細胞をマウスに注入すると、腫瘍を形成することを見いだし、2014年10月23日のCancer Cellオンライン版1に発表した。がんのエキソソームを分析することで、がんの進行を監視したり、治療標的を突き止めたりすることが可能になるかもしれない。
マックマスター大学（カナダ・ハミルトン）のがん研究者Khalid Al-Nedawiは、「この結果には驚きました。エキソソームは細胞のゴミ箱にすぎないと考えられていたからです。今回の研究によって、この微細な小胞の潜在能力を生かす手だてが見えてきました」と説明する。彼は今回の研究には参加していない。
（※mono....以下詳細はサイト記事で）
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危険な積み荷
がん細胞は正常細胞に比べて多くのエキソソームを放出することが以前に報告されている2。そこで、Kalluriのチームは、がん細胞のエキソソームと正常細胞のエキソソームの違いを調べることにした。培養して増殖させた細胞からエキソソームを単離して調べたところ、がん細胞のエキソソームにはマイクロRNA（miRNA）の産生に必要な構成成分（miRNAの前駆体分子やそれを切断して成熟miRNAに変える酵素）が含まれていることが分かった。miRNAは長さ20～25塩基の短いRNA断片で、標的遺伝子の発現を抑制することができる。
がん細胞由来のエキソソームにさらした正常細胞は、その遺伝子発現に変化が見られた。さらにこの細胞をマウスに注入すると、腫瘍を形成した。しかし、正常細胞由来のエキソソームにさらした正常細胞を注入しても、腫瘍は形成されなかった。また、miRNAを作る分子機構を阻害したがん細胞由来エキソソームにさらした正常細胞の場合は、腫瘍が形成されるがその増殖速度は遅かった。
Kalluriのチームはさらに、健常者8人と乳がん患者11人の血中からエキソソームを採集し、それぞれのエキソソーム検体にさらした正常細胞をマウスに注入したところ、乳がん患者由来の11検体中5検体で腫瘍増殖の誘導が観察された。一方、健常者由来のエキソソームでは、腫瘍形成の誘導は確認できなかった。
Kalluriによれば、エキソソームは血中から単離可能なことから、体内をかなり移動できると考えられるという。また、エキソソームの作用がたとえ局所に限られていたとしても、その作用によって近隣のがん細胞の悪性度が高まったり、正常細胞をがん細胞に転換させたりする可能性があると彼は話す。
エキソソームを阻害することでがんの進行を遅くするという案も浮かぶが、そう簡単にはいかないだろうとAl-Nedawiは話す。エキソソームの阻害によって正常細胞にどのような影響が及ぶか分からないからだ。それに、正常細胞が放出するエキソソームのうち一部のものはがんを防ぐタンパク質を含んでいる、という報告もある3。
一方で、エキソソームをがんの検診や経過観察に利用することならずっと現実的だろうとAl-Nedawiは言う。またKalluriも、エキソソームは、現在腫瘍の追跡に用いられている「血中循環腫瘍細胞（CTC）」よりも数が多くて単離が容易だと指摘し、こう話す。「血中には、さまざまな細胞が作り出すエキソソームが何百万個もあるのですから、ツールとしての威力は抜群です」。
（翻訳：船田晶子
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